劉婷 溫慧 滿都拉 陳忠軍 孫子羽

(內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018)

假單胞菌屬細菌是一類在自然界分布十分廣泛的微生物，在自然界以及生物體中都可見到，由其引起的感染在世界范圍內對人類造成了相當大的發(fā)病率和死亡率。假單胞菌屬細菌不僅可以感染人類，而且也是密集飼養(yǎng)的皮毛動物、水產養(yǎng)殖類動物和植物的致病菌，也是肉類、乳制品、蛋類等蛋白質食物的污染菌。

假單胞菌屬是一個異質性很強的屬，利用傳統(tǒng)的生理生化方法已滿足不了此屬微生物的分類。目前，主要是通過核酸雜交技術、(G+C)mol%含量測定和核酸序列分析等分子生物學的手段對其進行分類，其中利用16S rRNA序列分析是最常用的分子生物學方法。根據16S rRNA 序列的研究對假單胞菌屬分成以下7個組：銅綠假單胞菌組、熒光假單胞菌組、惡臭假單胞菌組、丁香假單胞菌組、施氏假單胞菌組、綠針假單胞菌組和穿孔素假單胞菌組[1-2]。目前就假單胞菌屬中研究最多的是銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌是條件致病性細菌，可引起許多嚴重的急、慢性感染，由其引起的肺炎、感染性休克、尿道、胃腸道感染和燒傷患者皮膚和軟組織等感染對人類造成了非常大的危害[3]，并且也是污染肉制品、涼拌即食食品、飲用水等食品的致病菌和腐敗菌[4]。除銅綠假單胞菌以外，其他假單胞菌也可引起嚴重的感染[5]。如變形假單胞菌可引起香魚類水產養(yǎng)殖動物的細菌出血。熒光假單胞菌是松材線蟲攜帶的主要致病菌[6]，也可引起冷藏食品的腐敗同時也是一種罕見的人類機會致病菌[7]。丁香假單胞菌是植物的致病菌，常引起植物的病變[8-9]。惡臭假單胞菌是魚的一種致病菌也會引起食物中毒和人類感染[10-11]。

假單胞菌本身細胞結構特點和抗生素濫用，導致其抗藥性嚴重，抗生素防治困難，運用噬菌體來控制假單胞菌將是一種新型手段。本文就假單胞菌噬菌體在食品、水產、植物、醫(yī)療領域的研究做一綜述。

1 噬菌體

噬菌體被定義為感染細菌的病毒。1917年加拿大微生物學家D'Herelle首次提出了噬菌體的概念[12]。到目前為止，噬菌體被認為是地球上最豐富最多樣化的微生物[13]。2011年，國際病毒分類委員會根據噬菌體病毒核酸類型、基因組、基本特性、形態(tài)結構以及宿主菌種類等特征將噬菌體進行了最新分類[14]。報告中所包含的噬菌體絕大多數是dsDNA噬菌體，而ssDNA、dsRNA和ssRNA噬菌體所占比例則相對較少。噬菌體在大多數環(huán)境中都普遍存在，包括人體皮膚，口腔和胃腸道等[15]。迄今分離的大多數噬菌體對其宿主而言具有相對高的特異性，不會觸及其他微生物菌群，這是噬菌體獨特的性質。其次噬菌體可以自我復制和自我限制，也就是說只要有宿主存在，低或單一劑量的噬菌體會成倍增加，使它們的抗菌素效應也成倍增加。噬菌體本身具有的防御機制，可以不斷地適應環(huán)境，在非常惡劣的環(huán)境條件下仍然具有很強的感染性，往往會繼續(xù)繁殖，直至宿主細菌的種群密度顯著降低[16-17]。噬菌體主要由核酸和蛋白質組成，因此噬菌體不會感染真核細胞[18]。噬菌體的這種優(yōu)勢降低了危害人體天然微生物菌群的風險，并消除了與化學抗生素相關的副作用、殘留。無論是噬菌體，還是噬菌體編碼的裂菌蛋白或噬菌體傳送的CRISPR系統(tǒng)都可以用來防控細菌、耐藥細菌的感染[19]。除了使用噬菌體來治療人類細菌性疾病，使用噬菌體制劑來治療由細菌引起的動物性[20]和植物性[21]疾病也引起了人們的重視，并且也正在開發(fā)一種使用噬菌體控制食物中的致病菌和腐敗菌的新型治療手段[22]。目前，銅綠假單胞菌噬菌體、熒光假單胞菌噬菌體、變形假單胞菌噬菌體和丁香假單胞菌噬菌體等都已經在各個領域中有了一些應用。因此運用噬菌體來預防和控制假單胞菌將會有很大的潛力。

2 噬菌體防控假單胞菌屬細菌的應用研究

2.1 在食品領域

微生物是影響食品品質的重要因素，在食品加工、運輸和貯藏過程中特別容易腐敗變質，這不僅影響食品的色香味而且也會導致食品污染甚至引起食品安全事故。目前化學防腐劑在食品工業(yè)生產中應用最多。但是化學防腐劑對人體存在很多潛在的危害，并且在食品生產工業(yè)中的應用也存在著不足，應用于食品工業(yè)中的這些化學防腐劑大部分沒有經過科學而全面的篩選，而且化學防腐劑的濫用和過量使用對消費者的身體健康造成了很大的危害，這已經引起了消費者對食品安全的重視[23-24]。所以，在食品領域需要研發(fā)一種綠色的、無毒無害的、應用前景良好的產品來防控和抑制微生物的影響。而噬菌體就是一個很好的選擇。

隨著生活水平的提高，乳制品已經是一種不可或缺的食品。假單胞菌是原料乳中一類主要的嗜冷菌，原料乳中的假單胞菌包括熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌等。熒光假單胞菌可以在低溫環(huán)境下生長繁殖，如果低溫冷藏條件下的原料乳被熒光假單胞菌感染[25]，該菌便會大量繁殖，并且逐漸變?yōu)閮?yōu)勢菌群。引起原料乳變質，使乳制品的口感與安全受到威脅[26]。Sillankorva等[27]以控制原料乳中假單胞菌為目標對熒光假單胞菌噬菌體ΦIBB-PF7A做了生理特性和基因組信息等研究。胡子毅等[28]從原料乳中分離篩選假單胞菌噬菌體，試驗結果顯示，不論在4℃還是在25℃條件下，噬菌體均能有效地在液態(tài)乳體系中控制假單胞菌的生長，同時還能顯著降低原料乳中的嗜冷菌數以及細菌總數并延緩細菌的生長速度。Hu等[29]從污水中分離出13種針對13種假單胞菌菌株的新型裂解噬菌體，試驗結果同樣表明，具有不同形態(tài)和生理特征的13種噬菌體可以有效控制生乳中假單胞菌的增長。假單胞菌不僅是乳品中的主要優(yōu)勢菌群。在有氧的條件下，假單胞菌菌也是導致肉品腐敗的主要優(yōu)勢菌群[30]。Greer[31]從冷卻牛肉中分離出假單胞菌噬菌體，試驗顯示假單胞菌噬菌體可以有效延長冷卻零售牛肉的貨架期。在國內，對肉中假單胞菌生長模型的研究比較多，而對其相應噬菌體的研究還比較少有待于進一步研究。平菇、雙胞蘑菇等食用菌是我國食用量很大的菇類，但是由于托拉假單胞菌所引起的細菌性斑點病不僅會降低這些菇類的產量，也會影響食用品質[32]。Kim等[33]從污水中分離出來了托拉假單胞菌噬菌體，試驗結果顯示噬菌體可以殺滅蘑菇組織中的病原菌，減少作物損失。食品致病菌和腐敗菌產生的巨大負面影響使得控制食品微生物污染的需求得到加強。使用噬菌體作為天然抗菌劑在控制食物病原體和腐敗微生物方面具有巨大的潛力。噬菌體適用于從農場到餐桌的每個環(huán)節(jié)，不論是食品加工設備還是食品運輸過程都可以使用噬菌體來進行防控，噬菌體也可以作為食品中的天然防腐劑，延長產品的保質期，保證食品質量[22,34]。噬菌體制劑在食品領域的研究越來越多，并且已經有很多噬菌體制劑用于食品中。

2006年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)為了控制單增李斯特菌的污染批準了ListShieldTM噬菌體產品可作為食品添加劑，相繼又有許多其他噬菌體雞尾酒產品(單增李斯特菌屬，沙門菌屬和大腸埃希菌屬等)被批準應用[35-36]。市售的假單胞菌噬菌體有 Omnilytics有限公司針對丁香假單胞菌的Agriphage噬菌體產品。Brimrose科技公司的針對銅綠假單胞菌的Pyo-bacteriophage和Intesti-bacteriophage噬菌體產品。我國雖然沒有批準應用的噬菌體產品，但是在使用噬菌體制劑來保障食品品質和安全方面已經有了不錯的成績。

2.2 在水產養(yǎng)殖領域

隨著經濟的發(fā)展，人類對海洋食品需求的增加，水產養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，但是由細菌和病毒感染所引起的疾病越來越嚴重，導致水產養(yǎng)殖部門遭受了巨大的經濟損失。而抗生素在水產養(yǎng)殖中的大量使用，對人類和動物的健康以及對環(huán)境的破壞也日益嚴重[37]。在這種情況下，高效環(huán)保的噬菌體療法正發(fā)揮著作用。

影響水產養(yǎng)殖的主要假單胞菌屬細菌有變形假單胞菌和銅綠假單胞菌。變形假單胞菌是革蘭陰性菌，在自然環(huán)境中常見。變形假單胞菌可引起香魚、大黃魚等水產養(yǎng)殖動物的細菌出血性敗血病，造成非常大的損失[38]。

Park等[39]在患有敗血病的香魚組織內和養(yǎng)殖香魚的池水中篩選出了兩株變形假單胞菌的噬菌體。在噬菌體治療試驗中，香魚被喂養(yǎng)含有變形假單胞菌的飼料，然后再分成4組分別喂食含有單一噬菌體、2種噬菌體混合制劑和不含有噬菌體浸漬的飼料。香魚的死亡率分別為53.3%、40.0%、20.0%和93.3%。試驗表明2種單一噬菌體對變形假單胞菌的抑制效果不同，但是含有2種噬菌體的混合制劑效果最佳。隨后Kawato等[40]對Park等[39]之前篩選出的變形假單胞菌噬菌體的基因組序列進行分析，結果再次驗證了之前Park等[39]的試驗結果，這兩種裂解噬菌體可以用作噬菌體制劑。因此，運用噬菌體制劑來有效控制香魚細菌性出血性敗血病是一種較好的選擇。而引起鯰魚物種潰瘍性病變的致病性細菌是銅綠假單胞菌。Khairnar等[41]運用噬菌體療法在8～10d內有效的治愈了被感染魚的潰瘍性病變，與未治療的魚相比感染降低了7倍。由此可知噬菌體療法也可以用于治療魚類潰瘍性病變。作為水產養(yǎng)殖中抗生素處理的替代或補充，噬菌體治療可能很快就會有潛在的應用。

2.3 在植物領域

植物細菌性疾病一直是影響農業(yè)發(fā)展的災害之一，而由丁香假單胞菌引發(fā)的植物病害發(fā)生率居十大細菌性植物病害之首[42]。

丁香假單胞菌是獼猴桃細菌潰瘍的致病因子，它給獼猴桃種植帶來了嚴重的經濟損失，然而采用傳統(tǒng)方法未能充分控制丁香假單胞菌的感染。Lallo等[43]從受感染的葉子和污水中分別分離篩選出噬菌體fPSA1和fPSA2，其中fPSA2是毒性噬菌體，可以感染所有丁香假單胞菌測試菌株。試驗結果為噬菌體治療獼猴桃細菌性潰瘍提供了一定的研究基礎。

丁香假單胞菌也是引起韭菜細菌性枯萎的致病因子，由于缺乏有效的控制措施，導致韭菜栽培出現了嚴重的問題。Rombouts等[44]從受感染的田中分離出5種新的噬菌體分別為vB_PsyM_KIL1、vB_PsyM_KIL2、vB_PsyM_KIL3、vB_PsyM_KIL4和vB_PsyM_KIL5。試驗中又加入另一種噬菌體vB_PsyM_KIL3b。經特異性生物測定結果證明了噬菌體vB_PsyM_KIL1、vB_PsyM_KIL2、vB_PsyM_KIL3和vB_PsyM_KIL3b在植物治療中的功效。此外，使用6種噬菌體混合物在田間試驗，試驗結果顯示噬菌體混合物可以控制韭菜細菌性枯萎病。

以上這些都可以表明噬菌體療法在植物病害防治方面有一些潛力，但后期需要在配方和應用方法上面進行優(yōu)化。噬菌體具有替代抗生素和化學藥品的潛力，商業(yè)化的丁香假單胞菌噬菌體產品已被用于植物疾病的防治[45]。

2.4 在醫(yī)學領域

出于安全性的考慮，假單胞菌噬菌體的試驗主要在動物模型中進行。在皮膚，角膜炎，肺部等感染模型中的治療都已經有了非常顯著的效果。Debarbieux等[46]使用生物熒光銅綠假單胞菌菌株監(jiān)測和量化噬菌體治療急性肺部感染小鼠的功效。結果顯示噬菌體治療不僅能有效地使動物免受致命性感染，而且在細菌感染前24h注入還可以預防肺部感染。Furusawa等[47]使用噬菌體來治療馬細菌性角膜炎，在角膜炎小鼠模型中，3h內施用噬菌體可以殺死細菌并抑制角膜炎。研究結果顯示噬菌體可完全預防由銅綠假單胞菌引起的角膜炎。除了使用小鼠做試驗，Beeton等[48]使用的蠟螟模型試驗也取得了成功。他們使用實驗室銅綠假單胞菌菌株PA01去感染蠟螟幼蟲，并且在感染前2h和感染后2h把不同感染復數的噬菌體注射到幼蟲血淋巴中。結果表明，感染24h后，噬菌體使血淋巴中的細菌細胞數量比未處理組低1000倍。Gu等[49]從水貂中分離純化出YH30噬菌體。宿主范圍測定顯示YH30對所有測試的銅綠假單胞菌菌株都具有感染性，試驗結果也顯示YH30噬菌體可以有效治療銅綠假單胞菌引起的出血性肺炎。這些試驗均擴大了噬菌體作為治療藥物的潛在用途。

銅綠假單胞菌是醫(yī)院內獲得性感染的重要致病菌。據估計，由燒傷所引起的死亡中至少有一半是因為感染了銅綠假單胞菌，并且感染銅綠假單胞菌的患者大多不可治愈[50]。銅綠假單胞菌一般情況下對多種抗生素耐藥，已被加入了“超級細菌”的行列[51]?？股匾呀洘o法達到理想的治療效果。而且在過去的30多年里，也一直沒有開發(fā)出新型的抗生素來治療銅綠假單胞菌所引起的病變。因此，需要制定新的預防和治療策略來控制燒傷患者的細菌性感染和銅綠假單胞菌耐藥性日益增多的現象，其中一種安全有效的方法就是噬菌體療法[52]。

1958年，我國第一位細菌學博士余?教授[53]在上海應用自制的銅綠假單胞菌噬菌體成功治愈了全國著名勞模邱財康的大面積燒傷，保全了他的肢體。這為我國銅綠假單胞菌噬菌體療法用于臨床中提供了研究依據。Marza等[54]用噬菌體成功治療了由銅綠假單胞菌感染的燒傷患者，并且在患者傷口感染處沒有分離出銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌不僅可以引起燒傷患者感染也是引起慢性中耳炎的病原菌。Wright等[55]使用噬菌體制劑治療銅綠假單胞菌引起的慢性中耳炎，試驗選取了24位持續(xù)患有慢性中耳炎2～58年的患者。參與者被隨機分為兩組，每組12人進行對照試驗，試驗結果表明噬菌體治療組患者的臨床各項指標得到改善且銅綠假單胞菌數量明顯降低，且并未發(fā)現任何的不良反應。對于治療多重耐藥性銅綠假單胞菌的感染，噬菌體制劑的臨床試驗結果顯示出了很好的療效同時也具有安全性。

3 總結與展望

目前，抗生素類藥品在防治腐敗菌和致病菌方面仍占有主導地位，但是由于抗生素的大量使用，也使得細菌的耐藥性不斷增強，甚至出現了“超級細菌”。而噬菌體作為一種新型的抗菌制劑與抗生素等抗菌劑相比在抗菌方面更適合長期的使用。噬菌體在替代化學防腐劑和抗生素方面有很多的優(yōu)點，也取得了巨大的成功，但是在食品、水產、植物甚至醫(yī)藥行業(yè)等領域應用還是有很大的阻礙。例如噬菌體的抑菌譜比較窄、以及噬菌體的安全性等問題都需要進一步研究驗證，但是隨著基因工程技術的不斷成熟，以及噬菌體與其他抗菌制劑的聯(lián)合使用[56]。使得噬菌體的研究和應用得到了進一步的發(fā)展，也解決了很多噬菌體可能帶來的安全隱患問題。國外商業(yè)化的噬菌體生物制劑在不斷增多，并且我國近些年來對噬菌體的關注也越來越多，噬菌體在不同領域的研究也取得了很多成果，我們應進一步深入地去研究并促進噬菌體制劑在各個領域中的發(fā)展應用。最后需要強調的是，如果有一天噬菌體被廣泛用于不同領域的時候，我們應該注意不要過度使用，抗生素就是一個很好的例子。