■楊 潔 郭利亞 王 宏 梁曉芳 李軍國 鄭銀樺 吳秀峰 薛 敏，3*

（1.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京100081；2.北京英惠爾生物技術有限公司，北京100081；3.農業(yè)部飼料生物技術重點開放實驗室，北京100081）

目前，植酸酶（Phytase）越來越多的應用于水產飼料中，以提高飼料中磷的利用率，減少魚類糞便中磷的排放。在魚類飼料中，植物性蛋白原料的添加量達30%以上，而在這些植物性蛋白中60%～80%的磷以植酸磷的形式存在，難以被魚類利用，而植酸酶可以將植酸水解為正磷酸鹽和肌醇或肌醇衍生物。日糧中添加植酸酶可以提高植物性飼料中磷的利用率并減少糞便中磷含量，可以提高動物的生產性能，降低植酸的抗營養(yǎng)作用，減少動物磷的排放，有效緩解磷對水體的污染。但植酸酶與所有的酶制劑一樣，對溫度、酸堿、水分及貯存等環(huán)境因素很敏感，尤其是溫度、水分對酶活性有很大的影響，水產飼料生產過程中的調質、擠壓膨化、制粒等高溫工序會嚴重破壞植酸酶的活性。目前，通過微丸包被技術、基因工程方法改良發(fā)酵菌株等手段，一定程度上緩解了水產飼料加工過程對酶活性的損耗，但受到工藝技術水平限制，耐高溫植酸酶的商品化、規(guī)?；a還有一定差距，現在市場上成熟的商品化植酸酶多為微生物來源的酸性植酸酶，適宜酸堿度小于7，較適合胃腸道為酸性條件的畜禽和有胃的魚類。植酸酶的不穩(wěn)定性使得植酸酶應用效果在不同研究結果間缺乏可比性，給植酸酶最適添加量的確定帶來了困難，限制了其應用。因此，本試驗研究耐高溫植酸酶的耐熱性能及酸性植酸酶和耐高溫植酸酶在擠壓膨化加工工藝、環(huán)模硬顆粒加工工藝和冷擠壓平模硬顆粒加工工藝下的損耗規(guī)律，為漁用顆粒飼料不同加工工藝條件下植酸酶劑型的選擇和合理添加提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 熱處理對市場主流品牌耐熱植酸酶活性損耗率的影響

針對市場主流品牌耐高溫植酸酶進行評估，樣品分別來自2個進口品牌和2個國產品牌，并分別命名為HDN、HX、HY和HDS。準確稱取0.200 0 g樣品，用少量緩沖液轉移到50 ml容量瓶中，定容，磁力攪拌條件下浸提30 min，取上清液進一步稀釋，使稀釋液酶活在20～30 U/ml左右，取上述稀釋液10 ml置于80℃的水浴中處理2 min，取出自然冷卻，測定處理后溶液中植酸酶活性，每個樣品重復測定3次。

1.2 飼料加工工藝對不同劑型植酸酶活性損耗率的影響

1.2.1 試驗設計

擠壓膨化制粒加工工藝試驗中采用魚類飼料配方（見表1），其中耐高溫植酸酶（HDN）和普通商品酸性植酸酶（NE）在試驗飼料中的添加量為5 000 FTU/kg（HDN-E和NE-E），制成擠壓膨化沉性顆粒飼料，粒徑2 mm；環(huán)模硬顆粒加工工藝試驗中采用生產鯉科魚飼料的實用配方（見表2），其中HDN和NE在試驗飼料中的添加量分別為4 000 FTU/kg（HDNP）和5 000 FTU/kg（NE-P），制成環(huán)模硬顆粒飼料，粒徑2 mm；冷擠壓平模硬顆粒加工工藝試驗配方同環(huán)模硬顆粒試驗配方（見表2），其中HDN和NE在試驗飼料中的添加量分別為4 000 FTU/kg（HDN-C）和8 000 FTU/kg（NE-C），制成冷擠壓硬顆粒飼料，粒徑2 mm。試驗飼料加工過程中配料工序采用由小到大逐級混合的方法，保證混合均勻，所有試驗飼料加工后均自然晾干。

表1 擠壓膨化試驗飼料配方及營養(yǎng)水平(%)

表2 環(huán)模硬顆粒和冷擠壓顆粒飼料配方及營養(yǎng)水平(%)

1.2.2 試驗飼料加工參數

擠壓膨化制粒加工工藝，采用北京洋工機械有限公司生產的TSE 65雙螺桿膨化機，擠壓膨化溫度140～175℃，試驗在中國農業(yè)科學院飼料研究所國家水產飼料安全評價基地飼料加工車間進行，加工工藝過程中采集喂料區(qū)，揉合區(qū)和模頭溫度、主機頻率、電流、喂料速度、切刀轉速等參數（見表3）。

環(huán)模硬顆粒加工工藝，采用江蘇牧羊集團生產的MUZL420顆粒機，調質溫度70～90℃，試驗在北京大北農集團飼料懷柔雁棲工廠生產車間進行，加工工藝過程中采集調質溫度、環(huán)模出口溫度、蒸汽閥開度、電流、頻率、料流量等參數（見表4）。

冷擠壓平模硬顆粒加工工藝，采用平模顆粒機，擠壓溫度60～66℃，試驗在中國農業(yè)科學院飼料研究所國家水產飼料安全評價基地進行，加工工藝過程中采集料倉溫度、出料口模板溫度、電流、模板轉速等參數（見表5）。

表3 擠壓膨化制粒工藝參數

表4 環(huán)模硬顆粒加工工藝參數

表5 冷擠壓平模硬顆粒加工工藝

1.2.3 取樣方法

按GB/T14699.1的規(guī)定進行采樣，將樣品密封待測。擠壓膨化加工工藝和冷顆粒加工工藝具體取樣方法如下：制粒前取樣，采用5點取樣法取混合后的粉料，每次兩個重復；制粒后取樣，試驗飼料自然晾干后，采用五點取樣法進行取樣，每次兩個重復，粉碎過0.45 mm標準篩后備用；環(huán)模硬顆粒加工工藝具體取樣方法如下：制粒前取樣，每隔3 min取混合后的粉料，共取8次，每次兩個重復；制粒后取樣，在出料口連續(xù)取樣，共取8次，每次兩個重復，粉碎過0.45 mm標準篩后備用。

1.3 酶活檢測方法

植酸酶產品的酶活檢測參照國家標準GB/T18634—2009，采用分光光度法測定。酶活力定義為：樣品在底物濃度為5.0 mmol/l、溫度為37℃、pH值為5.50的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U/g表示。

2 結果

2.1 熱處理對市場主流品牌耐熱植酸酶活性損耗率的影響

針對市場上常見的4種耐高溫植酸酶產品，考察熱處理對耐高溫植酸酶活性損耗率的影響，結果見表6。由表6可知，HDN和HX的耐熱性植酸酶經過熱處理后活性損耗率較高，分別為61.92%和80.07%，而HY和HDS的耐熱性植酸酶經過同樣的熱處理后活性損耗率較低，分別為11.26%和8.45%，說明熱處理對不同耐高溫植酸酶活性損耗的影響不同，其活性損耗率范圍為8.45%～80.07%。

表6 熱處理下耐高溫植酸酶活性損耗率

2.2 加工工藝對不同劑型植酸酶活性損耗率的影響

擠壓膨化加工工藝、環(huán)膜硬顆粒加工工藝、冷擠壓平模硬顆粒加工工藝對耐高溫植酸酶和普通酸性植酸酶活性損耗率的影響結果見表7。

表7 不同加工工藝條件下植酸酶活性損耗率

表7可見，在擠壓膨化加工工藝下，制粒后飼料中植酸酶活性均為50 U/kg。盡管添加了耐高溫植酸酶產品，但由于擠壓膨化加工工藝的調質溫度在140～175℃之間，可能已超過了其所承受的溫度極限，耐高溫植酸酶基本完全失活。耐高溫植酸酶雖然有較好的熱穩(wěn)定性，比普通商品植酸酶可耐受更高的加工溫度，但兩者均不適用于擠壓膨化加工工藝。

在環(huán)模硬顆粒加工工藝下，HDN-P制粒前植酸酶活性為5 686 U/kg，制粒后植酸酶活性為3 706 U/kg，植酸酶活性損耗率為34.81%；而NE-P制粒前植酸酶活性為6 636 U/kg，制粒后植酸酶活性為1 479 U/kg，植酸酶活性損耗率為77.71%，HDN與NE相比，植酸酶活性損耗率降低了2倍多，表現出了較好的熱穩(wěn)定性。在環(huán)模硬顆粒加工工藝下，調質溫度為70～90℃時，對兩種植酸酶都有一定的破壞，但沒有使其完全失活。

在冷擠壓平模硬顆粒加工工藝下，HDN-C制粒前植酸酶活性為4 490 U/kg，制粒后植酸酶活性為3 540 U/kg，植酸酶活性損耗率為21.15%；NE-C制粒前植酸酶活性為7 810 U/kg，制粒后植酸酶活性為5 670 U/kg，植酸酶活性損耗率為27.40%。在冷顆粒加工工藝中，溫度為60～66℃時，兩種植酸酶活性損耗率較低，同時與環(huán)模硬顆粒加工工藝比較，冷顆粒加工工藝中NE活性損耗率降低了近3倍。

3 討論

植酸酶水解底物的速度隨著溫度升高而加快，但它是一種蛋白質，高溫會使其活性下降乃至失活，其適宜溫度為40～60℃。植酸酶在某一溫度下變性的程度，與在該溫度下持續(xù)時間的長短有關，持續(xù)時間越長，變性程度越大。李富偉等研究發(fā)現，制粒專用植酸酶在調質溫度70℃左右，蒸汽壓力不高的情況下，酶活基本保持不變，性能比較理想；在飼料中添加120 g酶活為5 000 U/g的植酸酶，理論上顆粒中植酸酶含量應該為600 U/kg，當制粒溫度達到80℃以上時，酶活明顯降低，但總體保持在500 U/kg以上，植酸酶活性損耗率約為17%，制粒專用植酸酶仍具有較好的耐熱性能。王楓等研究發(fā)現，德國巴斯夫植酸酶在溫度30～50℃之間具有5 000 U/g以上的酶活，最適溫度為40℃，在80℃熱處理20 min可保持90%以上的酶活，在90℃熱處理20 min僅剩51.04%的酶活。王紅寧等研究發(fā)現，現有的用于商品化的植酸酶雖然具有較強的耐熱性，但在70℃下制粒試驗表明，其酶活損耗率約為25%，80℃以及更高的溫度使酶活損失更大。雷釗等研究發(fā)現，在85～95℃溫度范圍內，不論植酸酶是經水浴處理還是烘箱處理，酶活都隨著溫度的上升而下降。Jongbloed等研究發(fā)現，在制粒溫度接近80℃時，植酸酶的活性開始出現活動損失，同時會使飼料中磷酸鹽的可利用性降低。Simons等研究了制粒溫度對植酸酶活性的影響后發(fā)現，樣品在制粒前蒸汽加熱至50℃，制粒過程達到81℃時，植酸酶活性下降16%；樣品在制粒前蒸汽加熱至65℃，制粒過程達到84℃或87℃時，植酸酶活性分別降至原來的83%和46%。

植酸酶在飼料工業(yè)上應用，不僅需要具有酶解植酸磷的作用，還應達到具有熱穩(wěn)定性的要求，因此，科研工作者們想盡辦法從多方面研究提高植酸酶耐高溫性能的方法，而從基因技術上突破可以說是從本質上去解決植酸酶熱穩(wěn)定性的問題。Pasamontes等將煙曲霉的熱穩(wěn)定性植酸酶基因導入Asp.niger中，該植酸酶在100℃下經過20 min，酶活喪失10%，在90℃下120 min，仍有20%的活性，隨后其又將Asp.fungi植酸酶基因與載體連接后再進行基因重組，結果得到的植酸酶在90℃下處理80 min，酶活仍可保留40%。Lutz等利用A.niger的植酸酶基因，基于酶的二級結構原理在A.terreus的植酸酶表面進行離子交互作用和氫鍵搭橋實現了分子酶定向進化，提高了酶的耐熱性。Tye等從Bacillus subtilis168和B.licheniformis中發(fā)現兩種新型熱穩(wěn)定性的植酸酶，95℃保溫10 min后，仍能恢復80%的初始酶活。Kim等研究發(fā)現，芽孢桿菌B.sp.DS11植酸酶在90℃處理10 min后酶活可保留50%。另外，對植酸酶進行包被處理和添加穩(wěn)定劑也可以顯著提高植酸酶的耐熱性能。Ha等研究發(fā)現，淀粉液化芽孢桿菌植酸酶在90℃處理10 min后酶活可保留50%。蘇東海等研究了不同種類及不同濃度的糖、鹽在干熱及濕熱的情況下對植酸酶殘存酶活的影響，包被植酸酶在干熱的情況下殘存酶活比原酶有較大的提高，殘存酶活提高8.7%，濕熱的情況下，殘存酶活提高58.3%。Kerovuo等的研究發(fā)現，枯草芽孢桿菌植酸酶在5 mmol/l Ca2+溶液60℃培育10 min后保留酶活90%以上，若沒有Ca2+存在則無酶活，在含有Ca2+溶液中100℃保溫10 min仍保留酶活20%。目前對植酸酶熱穩(wěn)定性的研究溫度條件基本都在100℃以下，而擠壓膨化加工工藝中的溫度高達140～175℃，植酸酶的損耗規(guī)律尚不清楚，且植酸酶的熱穩(wěn)定性研究多限于試驗階段，在推廣應用上尚不成熟。

本試驗研究發(fā)現，飼料加工過程中的高溫對植酸酶活性影響較大，耐高溫植酸酶亦不能承受擠壓膨化加工工藝的溫度（140～175℃），兩種植酸酶幾乎全部失活。耐高溫植酸酶在環(huán)模硬顆粒加工工藝（70～90℃）中的活性損耗率為34.81%，在冷擠壓平模制粒加工工藝中的活性損耗率為21.15%，符合文獻中報道的不同耐高溫植酸酶經不同溫度處理能保持40%～90%的活性范圍，表現出了一定的耐熱性。普通酸性植酸酶在環(huán)模硬顆粒加工工藝中活性損耗率為77.71%，大大高于耐高溫植酸酶的活性損耗率，這是由于生產普通酸性植酸酶的菌株與耐高溫植酸酶不同，導致酶的結構不同，在耐熱性能上表現出差異；在冷擠壓平模制粒加工工藝中的活性損耗率為27.40%，這是因為冷擠壓工藝加工過程中溫度低于70℃，本試驗中溫度基本保持在60℃左右，所以普通酸性植酸酶在此溫度條件下有一定程度的損耗但能保留相對較高的酶活，與擠壓膨化加工工藝、環(huán)模硬顆粒加工工藝相比，在冷擠壓平模制粒加工工藝條件下其穩(wěn)定性更好。由此可知，不同植酸酶的耐熱程度不同，需根據其具體加工程序選擇植酸酶的種類并確定其最適添加量。

4 結論

本研究條件下，熱處理對不同耐高溫植酸酶活性損耗的影響不同，其活性損耗率范圍為8.45%～80.07%。采用內添加的方式添加植酸酶，在擠壓膨化加工工藝加工過程中，兩種植酸酶活性基本完全喪失，因此植酸酶（包括普通商品酸性植酸酶和耐高溫植酸酶）不適用于擠壓膨化加工工藝；環(huán)模硬顆粒加工工藝條件下，耐高溫植酸酶活性損耗率為34.81%，比普通酸性植酸酶低2倍多；冷擠壓平模制粒加工工藝條件下，兩種植酸酶活性損耗率都小于30%，且普通酸性植酸酶活性損耗率比環(huán)模硬顆粒加工工藝條件下降低近3倍。采用內添加方式添加植酸酶，不同加工工藝對植酸酶活性損耗率的影響由大到小依次為：擠壓膨化加工工藝＞環(huán)膜硬顆粒加工工藝＞冷擠壓平模硬顆粒加工工藝。