張 寧 ，邊育紅 ，張嘉麗 ，李 薇 ，宋新波 ，2

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2．天津中一制藥有限公司，天津 300193）

羊胎盤是連接母羊和胎兒，進行血液以及養(yǎng)分交換的組織，胎兒能夠從胎盤中獲得生長發(fā)育的各種養(yǎng)分，也是通過胎盤排泄自身的代謝產(chǎn)物。據(jù)《本草綱目》[1]記載：“羊胎，母羊腹中的胎獸，性味甘溫，具有益氣補虛，溫中暖下，調(diào)補腎虛、羸瘦之功效?！爆F(xiàn)代研究表明，羊胎盤具有調(diào)節(jié)機體免疫[2]、抗氧化[3]、抗疲勞[4]、保護皮膚[5]、提高消化功能[6]等作用。同時羊胎盤中含有豐富的微量元素和氨基酸、表皮生長因子等生物活性物質(zhì)，并且有研究發(fā)現(xiàn)[7]，羊胎盤較其它動物胎盤，與人胎盤的結(jié)構(gòu)和成分最為相似，另外，羊胎盤不會感染肝炎等病毒，不會與人類產(chǎn)生交叉感染，因此羊胎盤成為動物胎盤中能夠替代人胎盤的首選種類，在一定程度上有效解決了人類胎盤的數(shù)量緊缺以及使用的倫理問題。

本課題組將羊胎盤組織進行酶解制備羊胎盤肽粗品，按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003版）[8]中的規(guī)定，以小鼠負重游泳模型初步考察了其抗疲勞活性。多肽的分子量往往影響了其活性，有研究表明小分子肽，生物利用度更高，為了明確羊胎盤肽中的主要作用成分，便于后期的定向制備，提高羊胎盤肽的品質(zhì)和質(zhì)量，文章在前期的研究基礎(chǔ)上，將羊胎盤肽進行分子量分布分析，劃分為不同的分子量段，以噻唑藍（MTT（法篩選出不同分子量段的羊胎盤肽對骨骼肌成肌細胞的加藥濃度，并且比較了對L6細胞中三磷酸腺苷（ATP）濃度的影響。

1 材料和儀器

1.1 材料與試劑 大鼠L6骨骼肌成肌細胞購自貝爾格萊科技（天津）有限公司；高糖DMEM細胞培養(yǎng)基和PBS購自Hyclone公司；青霉素-鏈霉素混合液（雙抗）、胰蛋白酶和胎牛血清購自BI公司；MTT、DMSO購自 Solarbio 公司；細胞培養(yǎng)瓶（25 cm2，75 cm2）、離心管（15 mL，50 mL）、6孔板和 96孔板購自 Corning Costar公司；離心管（1．5 mL）購自 Axygen 公司；增強型ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乙腈購自Fisher公司；三氟乙酸購自博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；甘氨酸（Mr 75．05）購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；乙氨酰乙氨酰乙氨酸（Mr 189．1）、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸（Mr 451．2）、人血管緊張素Ⅱ（Mr 1045．5）、胰蛋白酶抑制劑（Mr 6511）、細胞色素 C（Mr 12355）均購自中國計量科學(xué)研究院。

1.2 設(shè)備與儀器 高效液相色譜儀，日本島津公司；TSK-GEL G2000SWxL凝膠色譜柱，日本東曹公司；冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；超凈工作臺，Thermo公司；超高速離心機，Thermo公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo公司；酶標(biāo)儀，Thermo公司；倒置顯微鏡，Nikon公司；Cellometer Mini全自動細胞計數(shù)儀，美國Nexcelom公司；恒溫搖床，Thermo公司。

2 方法

2.1 羊胎盤肽粗品分子量分布分析

2.1.1 標(biāo)準物質(zhì)溶液的配制 分別稱取甘氨酸、乙氨酰乙氨酰乙氨酸、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸、人血管緊張素II、胰蛋白酶抑制劑、細胞色素C各2．5 g，精密稱定，用超純水于1 mL容量瓶中定容，按照等比例將6種溶液混勻，過0．45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 供試品溶液的配制 取羊胎盤肽50 mg，精密稱定，用超純水于10 mL容量瓶中定容，過0．45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 采用凝膠過濾色譜法測定羊胎盤肽的相對分子質(zhì)量分布。色譜柱類型為TSKGEL G2000SWxL凝膠色譜柱。流動相：乙腈-水-三氟乙酸（20∶80∶0．07，v/v/v）。流速：0．6 mL/min。柱溫：30℃。進樣體積：10 μL。檢測波長：220 nm。

2.1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Shimadzu GPC數(shù)據(jù)處理軟件分析色譜圖。

2.2 不同分子量段羊胎盤肽的制備 按照“1．3．1”下的羊胎盤肽粗品分子量分布分析方法進行粗品的分段處理，收集相應(yīng)分子量段的樣品，進一步冷凍干燥，即得到不同分子量段的羊胎盤肽，分別命名為 F1～F6。

2.3 大鼠L6骨骼肌成肌細胞培養(yǎng) 實驗所用細胞為從貝爾格萊科技（天津）有限公司購買的第4代L6成肌細胞。細胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%雙抗的的高糖DMEM培養(yǎng)基。細胞增長至80%以上的時候進行傳代。細胞培養(yǎng)環(huán)境為5%CO2，37℃培養(yǎng)箱。當(dāng)細胞數(shù)量充足時，多余細胞用50%高糖DMEM、40%胎牛血清和10%DMSO配置的凍存液進行凍存。細胞計數(shù)采用Cellometer Mini全自動細胞計數(shù)儀。

2.4 大鼠L6骨骼肌成肌細胞增殖實驗

2.4.1 MTT法測定細胞增殖 取生長良好的大鼠L6骨骼肌成肌細胞，制備細胞濃度約1×105個/mL的L6成肌細胞懸液。于96孔細胞培養(yǎng)板中接種細胞，每孔 100 μL，置于 5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將96孔板中的培養(yǎng)基小心吸出并棄去，各加入100 μL用完全培養(yǎng)基稀釋的不同濃度F1～F4（每組6個副孔），再置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。輕輕吸棄上清液，加 MTT（5 mg/mL）10 μL/孔并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后加DMSO 150 μL/孔，充分振蕩約5 min并靜置20 min后用酶標(biāo)儀檢測在490 nm下的吸光度。

2.5 大鼠骨骼肌成肌細胞三磷酸腺苷（ATP）含量的測定

2.5.1 標(biāo)準曲線的繪制 用ATP檢測裂解液稀釋ATP 標(biāo)準溶液（0．5 mmol/L），配制成 0．01、0．05、0．1、0．5、1、5、10μmol/L濃度的ATP標(biāo)準溶液（冰上操作）。

2.5.2 樣品的準備 取生長良好的大鼠L6骨骼肌成肌細胞，制備細胞濃度約1×105個/mL的L6成肌細胞懸液。然后接種于6孔板中，每孔2 mL，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后小心吸出培養(yǎng)基并棄去，以MTT法篩選出的藥物濃度為基準，各孔加入2 mL用完全培養(yǎng)基稀釋的F1～F4（每組6個副孔），再置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。結(jié)束培養(yǎng)后，每孔加入1 mL胰蛋白酶，置于培養(yǎng)箱中孵育約1 min，直至大部分細胞被消化，然后每孔加入1 mL全培終止消化，并用移液槍小心吸取培養(yǎng)液吹打，盡量使細胞完全消化下來，并將各孔吸取至15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清，用1 mL全培重懸，計數(shù)，再分別加入適量全培將各管細胞調(diào)整為相同的細胞密度，混勻，各取出1 mL細胞懸液至1．5 mL離心管中，6 000 r/min，離心5 min，棄去上清，每管加入200 μL ATP檢測裂解液，用移液槍適度吹打，保證細胞能夠充分裂解（冰上操作）。12 000 r/min，4℃，離心5 min，取上清液用于后續(xù)測定。

2.5.3 ATP濃度的測定 以ATP檢測試劑：ATP檢測試劑稀釋液1∶4的比例配制ATP檢測試劑工作液（須避光）。在ATP標(biāo)準溶液孔和樣品孔中各加入100 μL ATP 檢測試劑工作液，室溫放置 3～5 min，然后相應(yīng)加入20 μL ATP標(biāo)準溶液和樣品，用移液槍頭混勻，并且采用具有l(wèi)uminometer功能的酶標(biāo)儀檢測。

2.5.4 數(shù)據(jù)處理 采用Graphpad prism 5進行方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示。檢測各組平均值之間的顯著性差異，P＜0．05 和 P＜0．01。

3 結(jié)果

3.1 羊胎盤肽粗品分子量分布分析 凝膠色譜利用分子篩原理，較大分子量的物質(zhì)先流出，而較小分子量的物質(zhì)后流出，又稱為排阻色譜，凝膠過濾色譜一般用于分離水溶性的物質(zhì)，如多肽、蛋白、糖類等。近年來，凝膠過濾色譜法被廣泛應(yīng)用于多肽的分子量分布測定中[9-10]，本研究以甘氨酸、乙氨酰乙氨酰乙氨酸、乙氨酰乙氨酰酪氨酰精氨酸、人血管緊張素Ⅱ、胰蛋白酶抑制劑、細胞色素C配制混標(biāo)，按“2．1．3”下色譜條件進行測定，色譜圖見圖 1。

圖1 混合標(biāo)準物質(zhì)凝膠過濾色譜圖

以6種標(biāo)準物質(zhì)相對分子質(zhì)量對數(shù)lgM對保留時間t做線性回歸，得到回歸方程lgM=-0．323 1t+7．4322，r=0．9969，說明在相對分子質(zhì)量 75．05～12 355范圍內(nèi)，6種標(biāo)準物質(zhì)相對分子質(zhì)量對數(shù)與保留時間呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準曲線見圖2。

圖2 混合標(biāo)準物質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準曲線

將羊胎盤粗品按“2．1．3”下色譜條件進行測定，色譜圖見圖3。

將羊胎盤肽粗品進行分子量分布分析，按照峰的個數(shù)劃分為F1～F6，其中F3占有總量面積最大，其次為F2，再次為F1。由于氨基酸的平均分子量為110，最小氨基酸為甘氨酸，其分子量為75．05，可以推測出F5和F6已不再是小肽或者氨基酸，不作為后續(xù)實驗的研究對象。詳細分子量分布見表1。

圖3 羊胎盤肽粗品凝膠過濾色譜圖

表1 羊胎盤肽粗品分子量分布

3.2 不同分子量段羊胎盤肽加藥濃度的篩選 MTT法常用于篩選各種細胞株加藥濃度[11]，本文參考Rekik等[12]設(shè)定的羊胎盤肽濃度，將凍干后得到的F1～F4 配制成 20、40、60、80、100 μg/mL 不同濃度的樣品加藥濃度為0 μg/mL的作為對照組，MTT結(jié)果見表2。

從表2可以看出，F(xiàn)4對L6細胞的增殖出現(xiàn)了輕微抑制作用，而F1、F2、F3則出現(xiàn)了不同程度的促進作用，其中F3從20 μg/mL就出現(xiàn)了明顯的促進增殖作用（P＜0．05），40 μg/mL 以及更大的濃度梯度時，F(xiàn)3的促增殖作用極其顯著（P＜0．01）。F3在20 μg/mL 時具有促進增殖作用（P＜0．05），而 F4 在20 μg/mL 時具有抑制增殖作用（P＜0．05）。實驗為了研究在不影響細胞增殖能力的前提下，羊胎盤肽對細胞中ATP濃度的影響，初步確定除F3和F4外，其余組分的濃度確定為20 μg/mL。F3和F4進行再一次的MTT實驗，將濃度梯度進行細化，實驗結(jié)果見表3。結(jié)合表3的結(jié)果，將F3濃度確定為5 μg/mL，將 F4濃度確定為 20 μg/mL 來進行后續(xù)的ATP測定實驗。

3.3 不同分子量段羊胎盤肽對L6成肌細胞中ATP濃度的影響

3.3.1 標(biāo)準曲線的繪制 測定不同濃度的ATP標(biāo)準溶液，標(biāo)準曲線如圖 4。Y=8449．6X+1027．7，R2=0．999 6，ATP 濃度在 0．01～10 μmol/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 不同分子量段羊胎盤肽對L6成肌細胞增殖的影響（±s，n=6）

表2 不同分子量段羊胎盤肽對L6成肌細胞增殖的影響（±s，n=6）

注：為統(tǒng)計學(xué)上差異顯著（*P＜0．05）；為統(tǒng)計學(xué)上差異極其顯著（#P＜0．01）。

樣品名稱 加藥濃度（μg/mL） 吸光度A490 SPP 0 0．478±0．019 20 0．478±0．017 40 0．507±0．026 60 0．542±0．067 80 0．539±0．038#100 0．516±0．055 F1 0 0．449±0．028 20 0．469±0．034 40 0．470±0．032*60 0．471±0．017*80 0．475±0．037 100 0．494±0．035#F2 0 0．431±0．036 20 0．434±0．032 40 0．454±0．016 60 0．456±0．023*80 0．463±0．021*100 0．469±0．034 F3 0 0．433±0．018 20 0．474±0．041*40 0．504±0．043#60 0．496±0．024#80 0．512±0．027#100 0．486±0．020#F4 0 0．491±0．007 20 0．461±0．026*40 0．479±0．036 60 0．484±0．034 80 0．506±0．027 100 0．513±0．045

3.3.2 L6成肌細胞中ATP濃度的測定 ATP是重要的信號分子，當(dāng)其發(fā)生水解時，形成ADP并釋放一個磷酸根，同時釋放能量，對于人類和動物來說，呼吸作用是產(chǎn)能的主要方式。ATP是肌肉收縮、神經(jīng)活動以及生物體內(nèi)的其他一切活動能量的主要來源，參與了多個組織和系統(tǒng)的不同效應(yīng)，包括參與神經(jīng)傳導(dǎo)和發(fā)育，參與傷害感受、聽覺、視覺、味覺功能，參與血小板凝集、平滑肌收縮/舒張及免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)肺及心血管功能等[13]，另外有研究發(fā)現(xiàn)ATP還參與了如細胞增殖、分化、遷移以及死亡等[14]。因此ATP濃度能夠直觀地反映出藥物對于機體或細胞能量代謝的影響。劉秀娜等[15]以ATP濃度為檢測指標(biāo)之一研究了益氣活血復(fù)方對心肌梗死后慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌能量代謝的影響。從本實驗ATP檢測結(jié)果可以看出，如表4，在選定的未影響細胞增殖能力的藥物濃度時，與未加入任何藥物的空白對照組比較，羊胎盤肽中的各個組分的ATP濃度都出現(xiàn)了升高，其中羊胎盤肽SPP和F3 的促進作用極其顯著（P＜0．01），并且 F3 組較 SPP組的ATP濃度要更高，說明F3是SPP中的主要活性成分。

表3 F3、F4 對 L6 成肌細胞增殖的影響（±s，n=6）

表3 F3、F4 對 L6 成肌細胞增殖的影響（±s，n=6）

注：為統(tǒng)計學(xué)上差異顯著（*P＜0．05）。

樣品名稱 加藥濃度（μg/mL） 吸光度A490 F3 0 0．397±0．018 5 0．404±0．018 10 0．432±0．026*20 0．454±0．048*30 0．456±0．056*40 0．448±0．049*F4 0 0．408±0．041 5 0．390±0．043*10 0．415±0．038 20 0．395±0．011 30 0．412±0．051 40 0．461±0．028*

圖4 ATP標(biāo)準曲線

表4 不同分子量段羊胎盤肽對L6成肌細胞ATP濃度的影響（±s，n=6）

表4 不同分子量段羊胎盤肽對L6成肌細胞ATP濃度的影響（±s，n=6）

注：為統(tǒng)計學(xué)上差異顯著（*P＜0．05）；為統(tǒng)計學(xué)上差異極其顯著（#P＜0．01）。

組別 ATP濃度（nmol/L）對照組 4．513±0．100 SPP 4．781±0．173#F1 4．578±0．079 F2 4．555±0．057 F3 4．940±0．239#F4 4．600±0．111

4 討論

一般將2～9個氨基酸組成的稱為寡肽，其中2～4個氨基酸組成的寡肽稱為小分子肽或小肽。小分子肽相對于氨基酸和蛋白質(zhì)來說，生物活性更好，對于機體而言具有吸收速度快、耗能低，生物利用度高等優(yōu)點，因此成為了近年來的研究熱點，涉及醫(yī)藥、保健食品、化妝品等多個領(lǐng)域。

經(jīng)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，羊胎盤肽具有良好的抗疲勞作用，能夠有效延長小鼠負重游泳時間，本實驗首先采用凝膠過濾色譜法將羊胎盤肽粗品進行分離收集、凍干，根據(jù)氨基酸的分子量估算，F(xiàn)5和F6已經(jīng)不再是氨基酸或者小分子肽，可能是一些雜質(zhì)或者不適于本凝膠過濾色譜柱的某些成分，因此并不作為本研究的研究對象。從能量代謝的角度進一步研究羊胎盤肽不同分子量段對于大鼠L6骨骼肌成肌細胞增殖能力的影響以及對其細胞中ATP濃度的影響，結(jié)合分子量分布，可以推測出羊胎盤肽中的寡肽能夠不同程度的促進骨骼肌成肌細胞的增殖。

本實驗通過MTT法篩選了不同分子量羊胎盤肽的加藥濃度，并且考察了各個肽段對大鼠L6骨骼肌成肌細胞ATP濃度的影響，結(jié)果顯示F3為羊胎盤肽中的主要活性成分，驗證了機體對于二肽和三肽的吸收利用的確優(yōu)于氨基酸和較大分子量的肽段和蛋白質(zhì)。同時本研究也為后期的定向酶法制備或者合成提供理論基礎(chǔ)。通過加入酶的種類、調(diào)整酶解條件來使F3的得率更高，有助于提高羊胎盤肽的品質(zhì)以及羊胎盤原料的利用度?；蛘呓?jīng)過質(zhì)譜鑒定F3中的主要肽段種類和結(jié)構(gòu)，通過化學(xué)合成專屬性得到此分子量段的小分子肽，將其應(yīng)用于抗疲勞藥品或保健食品的開發(fā)。