李 紅 ，陳 瑩 ，吳海紅 ，馬 坤 ，呂紹光 ，鄭姜?dú)J

（1．福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350001；2．福建省立醫(yī)院中醫(yī)科，福州 350001；3．福州中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122）

中國圍絕經(jīng)期婦女的失眠發(fā)病率高達(dá)66．7%，其中非器質(zhì)性失眠是失眠的最常見類型，表現(xiàn)為輾轉(zhuǎn)難眠、眠淺易醒、徹夜不眠等[1-2]。長(zhǎng)期失眠會(huì)使機(jī)體的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能紊亂，導(dǎo)致免疫力低下、抑郁、焦慮等不良情緒、慢性病和認(rèn)知功能障礙，甚至危及生命[3-4]。氣郁體質(zhì)是圍絕經(jīng)期失眠的最常見體質(zhì)之一，而且較其他體質(zhì)患者入睡更難[5]。正如《素問·痹論》云：“靜則神藏，躁則消亡?！毖芯匡@示[6-8]，肝郁可通過影響PI3K/Akt信號(hào)通路，從而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，而免疫調(diào)節(jié)因子白介素1-β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是 PI3K/Akt信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子之一，在睡眠調(diào)節(jié)方面起到重要作用。本研究通過觀察圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性失眠婦女的肝郁分級(jí)、PI3K/Akt信號(hào)通路各指標(biāo)和匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（PSQI）之間的相互關(guān)系，探討肝郁影響圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性失眠的可能免疫學(xué)機(jī)制。

1 臨床資料

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 本研究遵循人道主義，患者自愿參加本研究并簽署《知情同意書》。圍絕經(jīng)期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》[9]；非器質(zhì)性失眠診斷標(biāo)準(zhǔn)參照ICD-10[10]；肝郁積分和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照《證素辨證學(xué)》[11]。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡在40～55歲未絕經(jīng)或絕經(jīng)后1 a內(nèi)。2）卵泡刺激素（FSH＞10 U/L）。3）對(duì)睡眠的質(zhì)和（或）量不滿、入睡困難、輾轉(zhuǎn)難眠、眠淺易醒。4）失眠表現(xiàn)＞3次/周，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月以上。5）憂心失眠對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的不良損害。6）對(duì)睡眠的質(zhì)和/或量不滿意，并影響生活和工作能力。7）PSQI累計(jì)分大于7分。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）不滿足研究的納入條件。2）陰道出血長(zhǎng)期未治愈，且其原因未查明者。3）雙側(cè)卵巢缺失或已衰竭或發(fā)生嚴(yán)重器質(zhì)性病變者，乳腺惡性腫瘤。4）有雌、孕激素替代治療史。5）體內(nèi)重要臟器或系統(tǒng)發(fā)生嚴(yán)重疾病。6）因身體病變、精神嚴(yán)重異常、濫用食物或藥物引起的失眠，其他類型的失眠。7）近期發(fā)生炎癥，并予對(duì)癥對(duì)因治療者。

1.3 一般資料 選取2014年9月—2016年1月就診于福建省醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院、福建省第二人民醫(yī)院、福建省中醫(yī)藥研究院的圍絕經(jīng)期女性患者150例，均符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)，其中“肝郁0級(jí)組”30例、“肝郁1級(jí)組”40例、“肝郁 2級(jí)組”40例、“肝郁 3 級(jí)組”40 例，平均年齡（48．1±4．0）歲。

2 方法

2.1 檢測(cè)IL-1β、TNF-α的含量 根據(jù)北京北方生物公司生產(chǎn)的試劑盒操作說明測(cè)定人外周血血清中IL-1β、TNF-α的含量，試驗(yàn)方法為酶聯(lián)免疫的吸附法（ELISA）。

2.2 檢測(cè)磷脂酰肌醇3活酶（PI3K）、蛋白激活酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶 B（pAkt）蛋白含量及其mRNA水平

2.2.1 主要試劑 人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自Solaibio（北京）；蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購自Brij（上海）；BCATM試劑盒購自Thermo（美國）；PI3K兔抗人多克隆抗體、Akt兔抗人多克隆抗體、pAkt兔抗人多克隆抗體購自CST（美國）；β -actin Antibody、HRP goat anti-rabbit IgG 購 自Proteintech（美國）；Tranzol up購自全式金生物；RNA酶抑制劑購自 Epicentre（美國）；SuperScriptTMIII ReverseTranscriptase購自Thermo Invitrogen（美國）。

2.2.2 取材和保存 尚未絕經(jīng)者于月經(jīng)第3～5 d，已絕經(jīng)者時(shí)間可隨意，抽取空腹外周血，用Ficoll密度梯度離心法離心、提取PBMC，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ㄓ糜跈z測(cè)mRNA含量的PBMC需加入Tranzol up）。

2.2.3 WesternBlot檢測(cè) PI3K、Akt、pAkt蛋白含量 提取各樣本中細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配4%濃縮膠、8%分離膠，蛋白上樣量40 μg，在30 mA恒電流、4℃條件下轉(zhuǎn)膜1夜，常溫封閉孵育1 h，洗膜，置于相應(yīng)的兔抗人多克隆抗體中常溫孵育1．5 h，洗膜，再在兔二抗中常溫孵育1 h，洗膜，化學(xué)法發(fā)光、顯影，用ImageJ分析軟件測(cè)定各個(gè)蛋白的灰度值含量，結(jié)果以目的蛋白與β-actin的比值表示。

2.2.4 RT-QPCR檢測(cè) PI3K mRNA、Akt mRNA含量 提取各樣本中細(xì)胞的總RNA并測(cè)定其濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）的操作說明獲得cDNA，引物由上?？党缮镉邢薰旧a(chǎn)，以 β-actin為參照基因，β-actin引物序列：F:5'GTGGCCGAGGACTTTGATTG3'，R:5'CCTGTAACAACGCATCTCATATT3'；PI3K 引物序列：F:5'GGAAGCAG CAACCGAAACAAAG3'，R:5'TCGCCGTCCACCACTACAGAG3'；AKT 引物序列：F：5'CACACCACCTGACCAAGATG3'，R：5'GCACCCGAGAAATAAAAACC3'。按RT-QPCR試劑盒操作說明進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，條件：95℃預(yù)變性10min后，95℃10s，60℃60 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，95℃溶解曲線采集10 s，擴(kuò)增結(jié)果運(yùn)用ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR System軟件進(jìn)行分析，計(jì)算循環(huán)的閾值（Ct值），用 2-△△Ct表示肝郁組（肝郁1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)）目的基因的表達(dá)量相對(duì)于肝郁0級(jí)組的變化倍數(shù)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 20．0進(jìn)行分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)、四分位數(shù)表示，即M（P25～P75）。相關(guān)性分析用Pearson（正態(tài)分布）或Spearman（非正態(tài)分布），0．5≤|相關(guān)系數(shù) r|＜0．8 表示中度相關(guān)，0．8≤|相關(guān)系數(shù)r|≤1．0表示高度相關(guān)。正態(tài)分布：多組間差異性對(duì)比用ANOVA，兩組間對(duì)比用LSD（方差齊）或Games-Howell（方差不齊）。非正態(tài)分布：多組間對(duì)比用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，兩組間對(duì)比用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（若為非正態(tài)資料的兩組間比較，則用校正α=2×0．05/（4×3）=0．008 3，即P＜0．008 3表示兩組間比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝郁分級(jí)與PSQI、PI3K/Akt信號(hào)通路各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析 肝郁分級(jí)與PSQI呈中度正相關(guān)（P＜0．01）；肝郁分級(jí)和 PI3K、Akt、pAkt的蛋白表達(dá)量呈中度正相關(guān)（P＜0．01）；肝郁分級(jí)與 PI3K、Akt的 mRNA 含量呈中度正相關(guān)（P＜0．01）；肝郁分級(jí)與IL-1β、TNF-α 含量也呈中度正相關(guān)（P＜0．01）；同時(shí)PI3K與PI3K mRNA、Akt與Akt mRNA呈高度正相關(guān)（P＜0．01）；而且 IL-1β、TNF-α 均與 PSQI呈中度正相關(guān)（P＜0．01）。見表 1。

3.2 不同肝郁分級(jí)間PSQI、PI3K/Akt信號(hào)通路各指標(biāo)的比較

3.2.1 PSQI在不同肝郁分級(jí)間的比較 PSQI隨著肝郁分級(jí)的增高而增加，各肝郁分級(jí)間的PSQI的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=50．093，P＜0．01），而且 PSQI在肝郁各級(jí)間的兩兩比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．008 3）。見表 2。

表1 肝郁分級(jí)、PSQI、PI3K/Akt信號(hào)通路各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

表2 PSQI與肝郁分級(jí)間的關(guān)系 M（P25～P75）

3.2.2 IL-1β、TNF-α在不同肝郁分級(jí)間的比較 從表3得出，IL-1β、TNF-α的含量隨著肝郁分級(jí)的增加而上升，而且IL-1β、TNF-α在各肝郁分級(jí)間的差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別：F=28．643，P＜0．01；F=30．962，P＜0．01），同時(shí)，IL-1β、TNF-α 在肝郁分級(jí)間的兩兩比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。見表3。

表 3 IL-1β、TNF-α 在不同肝郁分級(jí)間的比較（±s）

表 3 IL-1β、TNF-α 在不同肝郁分級(jí)間的比較（±s）

肝郁分級(jí) 例數(shù) IL-1β（pg/L） TNF-α（ng/L）0 級(jí) 30 98．8±29．2 23．0± 8．2 1 級(jí) 40 114．2±22．6 29．9± 9．9 2 級(jí) 40 135．1±25．3 38．9±12．3 3 級(jí) 40 152．1±27．6 46．7±12．6

IL-1β、TNF-α在肝郁分級(jí)間的兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。

3.2.3 PI3K、Akt、pAkt在不同肝郁分級(jí)間的比較 PI3K、Akt、pAkt的含量也隨著肝郁分級(jí)的增加而上升，而且在各肝郁分級(jí)間的差別也有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別：F=44．951，P＜0．01；F=46．544，P＜0．01；F=54．084，P＜0．01），同時(shí)，PI3K、Akt、pAkt在不同肝郁分級(jí)間的兩兩比較也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。見表 4、圖 1。

表 4 PI3K、Akt、pAkt在不同肝郁分級(jí)間的比較（±s）

表 4 PI3K、Akt、pAkt在不同肝郁分級(jí)間的比較（±s）

肝郁分級(jí) 例數(shù) PI3K Akt pAkt 0 級(jí) 30 0．032 3±0．007 8 0．244 9±0．052 2 0．199 0±0．047 7 1 級(jí) 40 0．041 7±0．013 2 0．329 2±0．119 2 0．297 3±0．126 4 2 級(jí) 40 0．055 1±0．017 0 0．454 5±0．164 3 0．455 8±0．180 4 3 級(jí) 40 0．077 7±0．025 9 0．612 5±0．176 9 0．612 2±0．178 5

圖1 不同肝郁分級(jí)間PI3K、Akt、pAkt的比較

3.2.4 PI3K mRNA、Akt mRNA在不同肝郁分級(jí)間的比較 肝郁分級(jí)越高，PI3K mRNA、Akt mRNA水平越高，而且在各肝郁分級(jí)間的差別有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別：F=36．808，P＜0．01；F=45．291，P＜0．01），同時(shí)，PI3K mRNA、Akt mRNA在不同肝郁分級(jí)間的兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。見表 5。

表5 PI3K mRNA、Akt mRNA在不同肝郁分級(jí)間的比較（±s）

表5 PI3K mRNA、Akt mRNA在不同肝郁分級(jí)間的比較（±s）

肝郁分級(jí) 例數(shù) PI3K mRNA Akt mRNA 0 級(jí) 30 0．015 5±0．005 4 0．023 4±0．004 4 1 級(jí) 40 0．024 8±0．012 0 0．032 3±0．012 0 2 級(jí) 40 0．036 1±0．016 1 0．043 1±0．013 2 3 級(jí) 40 0．054 6±0．024 9 0．056 6±0．016 6

4 討論

調(diào)查顯示圍絕經(jīng)期婦女的失眠發(fā)病率達(dá)34%～37．5%，肝郁的發(fā)病率為32%[12]。圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性失眠除了腎虛的共同病因外，肝郁氣滯是該病發(fā)生發(fā)展的又一大誘因。由于圍絕經(jīng)期婦女大多處于40～55歲，掌握了許多工作經(jīng)驗(yàn)，在工作上正處于上升階段，在家庭中又處于上有老、下有小的狀態(tài)，繁重的工作壓力、瑣碎的生活事件和社會(huì)對(duì)其期望值不斷增加，加之圍絕經(jīng)期婦女精神較敏感，性激素水平不穩(wěn)定，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能紊亂，易誘發(fā)或加重肝郁。同時(shí)，圍絕經(jīng)期婦女腎精虧虛，水不涵木，致肝血不足，肝氣郁結(jié)，既擾亂心神，又血不能濡于心，故可誘發(fā)和加重失眠。同時(shí)，本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)[8]：在圍絕經(jīng)期婦女中，肝郁程度越重，失眠越嚴(yán)重；同時(shí)，非器質(zhì)性失眠組以肝郁2級(jí)、3級(jí)居多，即肝郁程度較重，無失眠組以肝郁0級(jí)為多，即肝郁程度較輕。

本課題研究結(jié)果顯示：肝氣郁滯與圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性失眠密切相關(guān)，結(jié)合前期研究結(jié)果，可得出結(jié)論：肝郁氣滯是圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性失眠發(fā)生或加重的重要原因之一，而且肝郁分級(jí)越高，失眠越嚴(yán)重，該結(jié)果與“情志致病”理論及古今學(xué)者、國內(nèi)外醫(yī)家的研究結(jié)論相一致[12-15]。

本研究結(jié)果顯示：圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性失眠患者的肝郁分級(jí)與PSQI及PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)下的PI3K、Akt、pAkt的蛋白表達(dá)量及其基因含量、IL-1β、TNF-α 水平均為中度正關(guān)性（0.5≤r<0.8，P＜0.01），而且上述各指標(biāo)在肝郁的各分級(jí)間的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義（P＜0.05），各觀察值在肝郁各級(jí)間的兩兩對(duì)比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義（P＜0.05）；同時(shí)，IL-1β、TNF-α與PSQI也表現(xiàn)為中度正相關(guān)（0.5≤r<0.8，P＜0.01），故肝郁分級(jí)、PI3K/Akt信號(hào)通路和該疾病三者之間的關(guān)系為：兩兩正相關(guān)，提示PI3K/Akt信號(hào)通路可能是肝郁影響圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性失眠的部分免疫學(xué)機(jī)制之一，其機(jī)制可能是通過肝郁引起PBMC中PI3K和Akt的mRNA含量增加，進(jìn)一步促使基因表達(dá)，啟動(dòng)PI3K/Akt信號(hào)通路，使PI3K、Akt、pAkt的蛋白含量也增加，經(jīng)過一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)后，促使人體血清中免疫調(diào)節(jié)因子IL-1β、TNF-α也隨之大量升高，最終影響睡眠進(jìn)程。該結(jié)果與國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果有相同之處[6-8，16]：肝郁可影響PI3K/Akt信號(hào)通路；而長(zhǎng)期的肝郁誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α 持續(xù)性大劑量升高；IL-1β、TNF-α 參與睡眠進(jìn)程；肝郁是失眠的重要病因。故今后可考慮通過疏解肝郁情緒、研究PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑以改善圍絕經(jīng)期婦女非器質(zhì)性失眠。