王賽賽 馬艷 劉洋

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的以腦膜為主的非化膿性炎性疾病。雖然TBM僅占結(jié)核病的1%左右[1]，但卻是結(jié)核感染最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式，具有較高的發(fā)病率和死亡率[2]。由于TBM早期癥狀不典型，誤診率多在30%左右[3]，常被誤診為化膿性腦膜炎、新型隱球菌性腦膜炎(cryptococcul neoformans meningitis，CNM) 和病毒性腦膜炎(viral meningitis，VM)等，導(dǎo)致早期診斷困難，延誤治療，顯著降低患者預(yù)后質(zhì)量。有研究表明，50%的TBM患者最終導(dǎo)致死亡或遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]，多發(fā)生在起病的6個(gè)月內(nèi)[4]，認(rèn)為與診斷和治療的延遲有關(guān)[5]。故早期診斷及鑒別診斷TBM并及時(shí)行抗結(jié)核藥物治療，對(duì)減少并發(fā)癥、提高治愈率、降低死亡率有重要意義。目前的診斷方法主要基于腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)MTB細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)及MTB侵入機(jī)體后CSF發(fā)生的一系列生物化學(xué)和微生物學(xué)變化，是診斷TBM的基礎(chǔ)。因此，筆者通過(guò)整理近年來(lái)檢測(cè)CSF方法的文獻(xiàn)，進(jìn)行分類(lèi)綜述與總結(jié)，為早期診斷與鑒別診斷TBM提供理論依據(jù)。

TBM的早期診斷

一、CSF細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

(一)抗酸桿菌涂片鏡檢

抗酸桿菌涂片鏡檢是實(shí)驗(yàn)室診斷的基礎(chǔ)，具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、報(bào)告結(jié)果快等優(yōu)點(diǎn)。最早由埃利希(Ehrlich)在1882年發(fā)明，但診斷MTB的準(zhǔn)確性并不理想；改進(jìn)后的齊爾-尼爾森染色法(Ziehl-Neelsen染色法，Z-N染色)雖陽(yáng)性檢出率僅提高至10%～20%[6]，但仍在臨床中廣泛應(yīng)用。有研究表明，該染色法檢測(cè)TBM患者的CSF時(shí)，需每毫升CSF中至少有5000～50 000個(gè)MTB[7]，且標(biāo)本量約為10～15 ml，但由于MTB致病機(jī)制的特殊性，CSF含菌量平均每毫升僅10個(gè)左右[8]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足檢測(cè)的需要，導(dǎo)致其診斷的準(zhǔn)確性較差。

為提高涂片鏡檢的敏感度，研究人員不斷優(yōu)化標(biāo)本采集程序、標(biāo)本加工和顯微鏡技術(shù)等[9-11]，但因標(biāo)本采集及加工的局限，顯微鏡的改進(jìn)成為研究重點(diǎn)。熒光顯微鏡是Z-N染色的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，與傳統(tǒng)的Z-N染色相比，不但可提高敏感度(痰液檢測(cè)時(shí)約提高10%)，還可減少檢測(cè)時(shí)間；發(fā)光二極管熒光顯微鏡(light-emitting diode fluor escence microscopy，LED-FM)因在結(jié)核病各標(biāo)本中的檢測(cè)敏感度高于常規(guī)熒光顯微鏡，且較氟化鉻染料(金胺-O或金胺-羅丹明)的熒光顯微鏡更為便宜而應(yīng)用廣泛[11-12]，但在肺外結(jié)核樣本中的準(zhǔn)確度還需進(jìn)一步驗(yàn)證[12]。

(二)MTB培養(yǎng)

CSF標(biāo)本中MTB的培養(yǎng)已成為確診TBM、判斷新開(kāi)發(fā)檢測(cè)方法的可行性和診斷價(jià)值的金標(biāo)準(zhǔn)。CSF培養(yǎng)較抗酸桿菌涂片鏡檢更為敏感，是目前診斷TBM特異度(100%)最高的方法[13]；但與CSF涂片鏡檢一樣受CSF中MTB含菌量少，以及培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)、需要3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室、敏感度低等影響，對(duì)TBM的早期診斷價(jià)值受限。其主要培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)方法因4～8周的培養(yǎng)時(shí)間而失去早期診斷意義；而近年來(lái)的液體培養(yǎng)方法，如BACTEC MGIT 960系統(tǒng)、BACTEC TB 460系統(tǒng)、MB/BacT系統(tǒng)和ESP系統(tǒng)Ⅱ等，雖較傳統(tǒng)培養(yǎng)法可以明顯縮短培養(yǎng)時(shí)間(至少10 d)，且敏感度達(dá)到16%～51%，但仍不足以滿(mǎn)足早期診斷[4]。2011年WHO推薦的顯微鏡觀察藥物敏感性技術(shù)(microscopic observation drug susceptibility，MODS)[14]是2000年Caviedes等建立的一種MTB實(shí)驗(yàn)室快速診斷和耐藥性測(cè)定技術(shù)，僅需1周即可獲得MTB培養(yǎng)及耐藥性檢測(cè)結(jié)果，快于商業(yè)固體或液體培養(yǎng)基[15]，敏感度可達(dá)65%[14]，在縮短檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)成本上具有優(yōu)勢(shì)[15-16]，但因受無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室條件的影響，目前僅應(yīng)用于TBM患者的藥物敏感性分析[17]。

二、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

(一)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)

核酸擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid amplification tests，NAAT)因可以檢測(cè)到少于10個(gè)微生物的標(biāo)本而被用于臨床標(biāo)本或培養(yǎng)中識(shí)別MTB[18]，并于1990年首次采用CSF標(biāo)本診斷TBM[19]，由此產(chǎn)生的多種PCR檢測(cè)方法因快速、敏感度和特異度高而在TBM診斷應(yīng)用方面具有較廣闊的前景。常規(guī)PCR對(duì)MTB檢測(cè)的敏感度為31%～100%，特異度為66%～100%[20]；但因該法只能定性檢測(cè)及擴(kuò)增產(chǎn)物易受污染的原因而改進(jìn)為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)、多重PCR(multiplex polymerase chain reaction，mPCR)、巢式PCR(nested PCR)等方法。

FQ-PCR是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Durg Administration，F(xiàn)DA)承認(rèn)并推崇的診斷技術(shù)，具有縮短操作及檢測(cè)時(shí)間、定量檢測(cè)、降低交叉感染風(fēng)險(xiǎn)的自動(dòng)化檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)[21]。相較于CSF涂片鏡檢、固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，具有較高的敏感度與特異度[22]。de Almeida等[23]的研究還顯示了當(dāng)循環(huán)閾值截?cái)嘀?cut-off值)≤39.5時(shí)可提高FQ-PCR檢測(cè)CSF樣本中MTB的診斷性能，提示將傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)和臨床算法相結(jié)合可提高其診斷價(jià)值。最新研究評(píng)估了4種DNA提取方法(苯酚-氯仿-硫氰酸酯胍、硅膠-硫氰酸胍、樹(shù)脂、乙醇樹(shù)脂)及FQ-PCR擴(kuò)增的3種靶點(diǎn)(IS6110、MPB64、hsp65KDa)對(duì)診斷TBM的價(jià)值，結(jié)果表明苯酚-氯仿-硫氰酸酯胍的提取方法聯(lián)合IS6110靶點(diǎn)檢測(cè)的效果最佳(敏感度為100%、特異度為98%)[24]，提示可通過(guò)最佳提取DNA和特異性靶點(diǎn)相結(jié)合檢測(cè)以提高FQ-PCR對(duì)TBM的診斷準(zhǔn)確度；但對(duì)于缺乏某一靶點(diǎn)的MTB菌株則難以檢測(cè)出來(lái)，因此mPCR技術(shù)顯得尤為重要。

mPCR通過(guò)在同一反應(yīng)體系里加入2對(duì)及2對(duì)以上的引物實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)核酸片段的擴(kuò)增，在提高通量、保持高特異度和高敏感度的同時(shí)能大大降低成本、節(jié)省樣本，更加簡(jiǎn)單、快速和高效。其診斷TBM價(jià)值高于CSF涂片鏡檢和培養(yǎng)[25]，敏感度高于單相PCR。多項(xiàng)研究已證明，多引物聯(lián)合的mPCR診斷TBM較單相PCR更有價(jià)值[26-27]。當(dāng)采用IS6110和16S rDNA序列對(duì)TBM與細(xì)菌性腦膜炎(bacterial meningitis，BM)進(jìn)行診斷及鑒別診斷時(shí)，其陽(yáng)性率為100%、特異度為96.5%[28]。然而，因mPCR的敏感度受到待測(cè)標(biāo)本數(shù)量的影響[29]，及對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員專(zhuān)業(yè)水平的高要求而難以在臨床中廣泛開(kāi)展。

巢式PCR是使用2對(duì)PCR引物進(jìn)行2個(gè)周期PCR反應(yīng)的技術(shù)，第1對(duì)PCR擴(kuò)增片段與普通PCR相似，第2對(duì)為結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部的巢式引物，可減少非特異性擴(kuò)增造成的污染。其DNA擴(kuò)增的敏感度和特異度明顯高于傳統(tǒng)的單步PCR[30]；診斷TBM的敏感度高于CSF涂片鏡檢、羅氏固體(L-J)和BacT/ALERT培養(yǎng)[31]。但由于巢式PCR有較高的假陰性和假陽(yáng)性率，不能作為啟動(dòng)或終止TBM治療的標(biāo)準(zhǔn)，需結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及細(xì)胞學(xué)和微生物學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷[31]。近年來(lái)，該技術(shù)與FQ-PCR 和mPCR等相結(jié)合，均取得較好的臨床診斷結(jié)果[30，32]。

(二)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)

LAMP技術(shù)是2000年日本學(xué)者Notomi等[33]發(fā)明的一種新的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，可以在恒定溫度下單支試管中擴(kuò)增DNA，避免了PCR的熱循環(huán)，使其更適合于資源有限的環(huán)境[34]。與PCR相比，檢測(cè)MTB的下限提高了10倍[35]，更適用于含菌量較低的標(biāo)本檢測(cè)；與FQ-PCR相比，盡管檢測(cè)MTB的敏感度相當(dāng)，但檢測(cè)時(shí)間僅1 h，且無(wú)需昂貴的檢測(cè)儀器[36]。在LAMP首次應(yīng)用于TBM診斷的研究中發(fā)現(xiàn)，以插入序列IS6110設(shè)計(jì)的6條引物診斷TBM的敏感度(88.23%)和特異度(80%)優(yōu)于巢式PCR(分別為52.9%和90%)、CSF涂片鏡檢和培養(yǎng)[36-37]。最新的Meta分析也證實(shí)了LAMP診斷肺外結(jié)核的準(zhǔn)確性，且該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，對(duì)于缺乏經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員培訓(xùn)后即可開(kāi)展實(shí)驗(yàn)[38]。

(三)線性探針技術(shù)(line-probe assays，LPAs)

LPAs是基于mPCR原理，并將PCR擴(kuò)增、反向雜交、膜顯色技術(shù)合為一體的快速診斷結(jié)核病及藥物耐藥性的實(shí)驗(yàn)方法。具體包括分子線性探針?lè)?INNO-LPA)、Geno-type MTBDR分子線性探針?lè)?、自身免疫性診斷MTB耐藥分子線性探針?lè)?the autoimmun diagnostika TB resistance line probe assay，AIDLPA)和反向雜交MTB耐藥分子線性探針?lè)?the REBA MTB-rifa@assay，REBA-LPA)[39]，四類(lèi)方法檢測(cè)MTB及其耐藥的效果相當(dāng)[40]。2008年WHO正式推薦使用LPAs檢測(cè)肺外結(jié)核標(biāo)本[41]，但不同研究對(duì)于TBM診斷的結(jié)果相差較大[42-44]，這可能是CSF標(biāo)本含菌量較低、目的基因擴(kuò)增量少和DNA提取過(guò)程易受外界影響等原因造成。同時(shí)LPAs還存在操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、探針有限、需要專(zhuān)用PCR空間降低污染的風(fēng)險(xiǎn)，以及污染問(wèn)題的處理比較棘手、需要適當(dāng)?shù)幕A(chǔ)設(shè)施及技術(shù)熟練的實(shí)驗(yàn)員等問(wèn)題，其早期診斷的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。

(四)GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)(簡(jiǎn)稱(chēng)“GeneXpert”)

GeneXpert是一項(xiàng)全自動(dòng)半巢式FQ-PCR體外診斷技術(shù)，只需2 h即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)MTB定性和利福平(RFP)耐藥性檢測(cè)[45]，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法有相似或更高的收益，報(bào)告結(jié)果更快，更適用于早期診斷[46]。2013年WHO用于成年人和兒童肺外結(jié)核及疑似TBM患者的CSF檢測(cè)診斷[47]。但因研究數(shù)據(jù)質(zhì)量較低[47-48]、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值較低[49-50]，以及需CSF標(biāo)本量大等原因使得GeneXpert對(duì)TBM的診斷價(jià)值有所不同，需要重新評(píng)估。強(qiáng)調(diào)增加CFS標(biāo)本量、改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化CSF標(biāo)本處理以獲取最大化的診斷敏感度和特異度[51-53]。此外，在資源有限的環(huán)境中實(shí)現(xiàn)GeneXpert檢測(cè)也有局限和挑戰(zhàn)[54]，尤其在HIV感染高發(fā)的地區(qū)，檢測(cè)TBM的敏感度可低至36%[53]。2017年WHO建議新一代的GeneXpert MTB/RIF Ultra替代GeneXpert，可使GeneXpert單元檢測(cè)限從114個(gè)/ml菌落降低到15.6個(gè)/ml，提高了檢測(cè)敏感度[55]，彌補(bǔ)了CSF中MTB較少的不足，但同時(shí)也降低了特異度[56]，將之作為優(yōu)先初步診斷方法應(yīng)更為謹(jǐn)慎。

三、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

(一) γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assays，IGRAs)

IGRAs作為國(guó)際上篩查潛伏性結(jié)核感染的最新方法已上市10余年，主要通過(guò)測(cè)定早期分泌靶抗原6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)刺激外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素水平來(lái)診斷結(jié)核病，但因診斷TBM所需CSF標(biāo)本量大(>2 ml)、結(jié)果準(zhǔn)確度不高(15%)、耗時(shí)較長(zhǎng)等原因無(wú)法作為早期診斷的確診方法，但可以作為輔助手段服務(wù)于臨床。

雖然IGRAs對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值有限[57]，但其在局部特異性淋巴細(xì)胞上的應(yīng)用可能具有診斷價(jià)值[58]。一項(xiàng)最近的Meta研究，分析了近幾十年包括8項(xiàng)血液標(biāo)本和6項(xiàng)CSF 標(biāo)本的IGRAs診斷TBM的方法[59]，匯總敏感度、特異度分別為78%和77%、61%和88%，且CSF標(biāo)本的特異度高于血液。但也有研究認(rèn)為，二者敏感度與特異度受閾值(cut-off value)的影響較大，總體ROC曲線下面積對(duì)估計(jì)總體診斷價(jià)值應(yīng)更為可靠。有研究表明，采用血液標(biāo)本與CSF 標(biāo)本的IGRAs法診斷TBM的ROC曲線下面積均低于采用NAAT[60]和腺苷脫氨酶(ADA)[61]進(jìn)行診斷時(shí)，且診斷時(shí)間(約為16 h)長(zhǎng)于NAAT和ADA[62]，提示采用血液標(biāo)本與CSF標(biāo)本的IGRA法的整體診斷價(jià)值可能低于NAAT和ADA。

(二)抗原抗體檢測(cè)技術(shù)

CSF中MTB抗原抗體檢測(cè)的研究已開(kāi)展30余年，主要的抗原有GlcB、HspX、白細(xì)胞介素等，主要的抗體有抗-19 kD、抗-38 kD、抗-ESAT6、抗-抗原5等。Haldar等[63]對(duì)532例印度TBM患兒采用FQ-PCR和抗原抗體方法(GlcB、HspX、MPT51、Ag85B和PstS1)檢測(cè)CSF中MTB進(jìn)行前瞻性診斷評(píng)估，發(fā)現(xiàn)GlcB、HspX和MPT51抗原檢測(cè)的敏感度和特異度分別為92%～95%和93%～96%，且與FQ-PCR聯(lián)合檢測(cè)時(shí)可確診所有TBM患者，特異度極高。Huang等[64]Meta分析了近年來(lái)基于CSF中抗體檢測(cè)的TBM診斷方法，納入的36篇文獻(xiàn)(58項(xiàng)研究)中抗體檢測(cè)的敏感度為0.75(95%CI：0.66～0.82)，特異度為0.98(95%CI：0.96～0.99)，ROC曲線下面積(AUROC)為0.97(95%CI：0.95～0.98)；在亞組分析中，抗-M37Ra(AUROC=0.99; 95%CI：0.98～1.00)檢測(cè)高于抗-抗原5[AUROC=0.99，95%CI：0.97～0.99]和抗-M37Rv[AUROC=0.97，95%CI：0.95～0.98]，對(duì)TBM的早期診斷具有重要意義。但由于對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染后宿主和細(xì)菌的反應(yīng)知識(shí)不完整，該方法的應(yīng)用具有嚴(yán)重的局限，未能轉(zhuǎn)化為常規(guī)的臨床檢測(cè)。

(三) 腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)檢測(cè)

機(jī)體感染MTB后，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)失衡，由此生成的ADA廣泛分布于體液中。在正常CSF中ADA水平為 6～8 U/L，而在TBM患者中可升高至31.2 U/L[65]，因此可通過(guò)檢測(cè)CSF中ADA的含量來(lái)診斷TBM，具有較高的敏感度與特異度[66]。但不同地區(qū)ADA的cut-off值具有較大差異[67-68]，不能確定合適的cut-off值來(lái)鑒別TBM和細(xì)菌性腦膜炎(BM)[69]。目前，我國(guó)對(duì)ADA診斷TBM的cut-off值尚無(wú)統(tǒng)一界定。盡管ADA的檢測(cè)是一項(xiàng)簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的診斷方法，但TBM患者CSF中ADA的升高并非特異性，尤其在并發(fā)HIV感染的患者中診斷價(jià)值更為有限[69]。

(四)皮質(zhì)醇檢測(cè)

皮質(zhì)醇是壓力刺激(如感染、創(chuàng)傷或大手術(shù))后腎上腺產(chǎn)生的一種脂溶性小分子，在劇烈的壓力條件下可迅速產(chǎn)生，且可長(zhǎng)時(shí)間(幾天至幾個(gè)月，甚至幾年)保持在較高水平[70]，具有快速、成本低等優(yōu)勢(shì)，但其診斷TBM的準(zhǔn)確性有待于進(jìn)一步研究。Holub等[71]發(fā)現(xiàn)BM患者CSF中的皮質(zhì)醇水平升高，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。Mahale等[72]對(duì)20例TBM患者、20例無(wú)菌性腦膜炎(AM)患者和25例無(wú)神經(jīng)障礙的對(duì)照組患者檢測(cè)CSF皮質(zhì)醇水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，TBM患者平均CSF皮質(zhì)醇水平(8.82 μg/dl)明顯高于AM組(3.47 μg/dl)和對(duì)照組(1.05 μg/dl)(P值均<0.001)，同時(shí)CSF檢測(cè)還可發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)升高、低血糖和淋巴細(xì)胞增多癥等結(jié)果；而AI-Mendalawi[73]的研究就CSF中皮質(zhì)醇的cut-off 值未能在印度臨床環(huán)境中得到實(shí)際應(yīng)用，及ADA替代皮質(zhì)醇方法有優(yōu)勢(shì)等原因，對(duì)Mahale等[72]的觀點(diǎn)持懷疑態(tài)度，說(shuō)明CSF中皮質(zhì)醇的檢測(cè)意義還需深入研究。

四、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是聯(lián)合雙向電泳和高分辨率質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)對(duì)疾病的相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模篩選的技術(shù)。Yang等[74]采用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(iTRAQ-LC-MS/MS)的定量蛋白組學(xué)技術(shù)，在TBM組和健康對(duì)照組CSF中共鑒別出81種差異蛋白，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(western blotting，WB)驗(yàn)證結(jié)果指出TBM患者潛在生物標(biāo)志物尼爾樣-2型分子(Nel-like type 2 molecule，NELL-2)水平顯著下降，敏感度和特異度分別為83.3%和75%，具有良好的診斷效能。Kumar等[75]采用同樣方法不僅能識(shí)別出已知的差異蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPA)和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族A成員6(PDIA6)，還能識(shí)別出新型過(guò)表達(dá)蛋白雙載蛋白(AMPH)和神經(jīng)束蛋白(NFASC)，以及下調(diào)的鐵蛋白輕鏈(FTL)，并對(duì)新型差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。然而，這些差異蛋白的研究都是基于小樣本資料，若應(yīng)用于臨床診斷TBM還需大樣本多中心的研究進(jìn)行證實(shí)。

代謝組學(xué)是對(duì)生物樣品中代謝物綜合圖譜進(jìn)行定量分析的研究，不僅可為疾病的代謝途徑提供新的見(jiàn)解，還可確定潛在的疾病標(biāo)志物[76]。該方法已用于TBM的研究，目前主要為核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)譜和MS分析平臺(tái)。盡管NMR是高度量化和可重復(fù)的，但較低的敏感度大大限制了其在代謝組學(xué)中的應(yīng)用；MS通常與各種色譜系統(tǒng)組合，敏感度和分辨率均高于NMR[77]。氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)氨基酸譜的分析可準(zhǔn)確識(shí)別出TBM患者中丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、賴(lài)氨酸和脯氨酸的升高[78]，有助于TBM的早期診斷和治療。但目前的分析技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)所有低相對(duì)分子質(zhì)量代謝物的鑒別和定量，大多數(shù)研究的目的主要是獲得TBM發(fā)病機(jī)制的生物學(xué)解釋?zhuān)皇谴_定診斷價(jià)值。因此，診斷TBM的潛在標(biāo)記物還需大樣本研究進(jìn)行驗(yàn)證。

TBM的鑒別診斷

一、TBM與化膿性腦膜炎的鑒別診斷

TBM是MTB引起的腦膜非化膿性炎性疾病，與化膿性腦膜炎相比，檢測(cè)化膿性細(xì)菌感染后升高的指標(biāo)是最直接的鑒別方法。C-反應(yīng)蛋白(CRP)在化膿性細(xì)菌感染4～6 h內(nèi)迅速增加，上升速度快于TBM，30～50 h達(dá)到高峰值，可為正常值的100～1000倍，其半衰期短，約4～6 d[79]；且CRP水平不受放療、化療、糖皮質(zhì)激素治療的影響，對(duì)鑒別早期感染性疾病的效果優(yōu)于CSF中有核細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)及早期蛋白定性等項(xiàng)目[80]，可作為感染初期診斷指標(biāo)。

另外，還可通過(guò)直接比較CSF和血漿中生化指標(biāo)比值的差異性進(jìn)行鑒別[81-83]：TBM組CSF中氯化物、乳酸、CD64比值低于化膿性腦膜炎組，ADA、組蛋白高于化膿性腦膜炎組(P值均<0.01)，兩組CSF與血漿糖比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TBM組血漿蛋白、組蛋白、氯化物、氮化物、乳酸均低于化膿性腦膜炎組，而ADA高于化膿性腦膜炎組(P<0.05)。

CSF細(xì)胞學(xué)是通過(guò)檢測(cè)CSF中細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)改變，以及各種細(xì)胞的百分比來(lái)進(jìn)行研究。多數(shù)研究表明，化膿性腦膜炎CSF細(xì)胞學(xué)呈中性粒細(xì)胞增多反應(yīng)，而TBM呈中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等混合細(xì)胞增多反應(yīng)，具有診斷及鑒別診斷兩病的重要意義[84-85]。

二、 TBM與CNM的鑒別診斷

CNM是新型隱球菌引起的腦膜非化膿性炎癥，其臨床表現(xiàn)、CSF檢測(cè)和影像學(xué)方面與TBM極為相似[86-87]。由于我國(guó)結(jié)核病疫情較重，臨床醫(yī)師在診斷時(shí)會(huì)首先想到TBM而造成誤診，導(dǎo)致治療不及時(shí)、預(yù)后差等問(wèn)題；因此提高對(duì)CNM的認(rèn)識(shí)，在未找到隱球菌前對(duì)疑似TBM而CSF不符合典型改變者，或疑似TBM但抗結(jié)核藥物治療無(wú)效者，尤其對(duì)與禽類(lèi)有密切接觸史者，以及長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和HIV感染或AIDS患者應(yīng)警惕并發(fā)CNM的可能[87]，采用多項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)有利于早期診斷[86-87]。

CSF涂片墨汁染色法是采用印度墨汁對(duì)離心沉淀后的CSF標(biāo)本染色，通過(guò)鏡下背景呈黑褐色而菌體不著色的現(xiàn)象檢測(cè)CNM。目前，根據(jù)CSF涂片墨汁染色的病原學(xué)方法找到隱球菌或CSF檢測(cè)隱球菌抗原陽(yáng)性與TBM鑒別，可確診CNM[88]。但CSF檢測(cè)隱球菌抗原培養(yǎng)法周期長(zhǎng)、敏感度低，難以早期診斷，影響患者預(yù)后。另外，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)可通過(guò)檢測(cè)MTB感染后特異性T細(xì)胞分泌的γ干擾素來(lái)快速判斷近期是否感染結(jié)核，該方法2 d即可得出結(jié)果，在排除顱外結(jié)核感染后可作為鑒別TBM和CNM的輔助方法[89]，但由于檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較高而未在臨床廣泛應(yīng)用。

三、 TBM與VM的鑒別診斷

由于TBM與VM的病程相似，CSF的某些臨床檢測(cè)結(jié)果相同，因此在臨床上難以區(qū)分[90]，一旦誤診而應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療后會(huì)引起MTB全身播散，后果極為嚴(yán)重。鄒德智[91]的研究中對(duì)TBM和VM的CSF中乳酸水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TBM 的CSF中乳酸均值(>3 mmol/L)高于VM均值(<2 mmol/L)，提示乳酸含量具備兩者鑒別診斷的價(jià)值，尤其是初次檢查結(jié)果還與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。

CSF細(xì)胞學(xué)檢查操作簡(jiǎn)便，所需時(shí)間短，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的鑒別診斷、病情和療效評(píng)估有重要價(jià)值，值得大力推廣應(yīng)用。熊林和宋濤[92]通過(guò)探討TBM與VM早期CSF細(xì)胞學(xué)情況，發(fā)現(xiàn)TBM嗜中性粒細(xì)胞所占比例明顯高于VM。鄭立恒等[93]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，并表明多數(shù)VM的CSF白細(xì)胞中嗜中性粒細(xì)胞在1～3 d內(nèi)迅速減少或消失，隨后出現(xiàn)淋巴細(xì)胞學(xué)反應(yīng)，隨病情好轉(zhuǎn)細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常；TBM早期CSF白細(xì)胞以嗜中性粒細(xì)胞為主，隨后呈混合細(xì)胞學(xué)反應(yīng)，嗜中性粒細(xì)胞多在1個(gè)月后才有明顯降低，隨病情好轉(zhuǎn)淋巴細(xì)胞升高直至正常。

四、多種腦膜炎間的鑒別診斷

結(jié)核感染時(shí)隨著MTB越過(guò)血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使得CSF呈現(xiàn)出淋巴細(xì)胞優(yōu)勢(shì)、蛋白質(zhì)含量增加和低葡萄糖濃度的代謝改變過(guò)程。近年來(lái)，對(duì)于TBM與其他腦膜炎的鑒別診斷開(kāi)始關(guān)注各疾病間代謝產(chǎn)物的變化。Dai等[94]通過(guò)全球代謝組學(xué)分析來(lái)鑒別TBM與VM、BM和CNM之間差異表達(dá)的代謝物，采用超高效液相色譜聯(lián)用飛行四極桿時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF-MS)來(lái)分析患者CSF中的代謝物，發(fā)現(xiàn)4種腦膜炎代謝特征的改變，其中TBM的代謝物和途徑均有氨基酸、脂質(zhì)和核酸的代謝參與，為T(mén)BM的診斷及鑒別診斷提供了有價(jià)值的信息。在未來(lái)的研究中，應(yīng)注重驗(yàn)證研究結(jié)果和分析代謝產(chǎn)物的改變與疾病病理生理學(xué)之間的聯(lián)系。

總 結(jié)

綜上所述，TBM目前還沒(méi)有一種高效、經(jīng)濟(jì)、便捷的診斷方法，最終確診應(yīng)結(jié)合患者具體臨床表現(xiàn)、CSF檢查和診斷性抗結(jié)核藥物治療的效果。CSF涂片鏡檢和培養(yǎng)法敏感度和特異度均較低，所需CSF標(biāo)本量多，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，雖在近年來(lái)對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)，但效果仍不盡如人意，對(duì)早期診斷價(jià)值有限。PCR及相應(yīng)分子水平技術(shù)檢測(cè)CSF中 MTB的方法提高了敏感度與特異度，但所需儀器設(shè)備的高昂價(jià)格及對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的高要求，使得在中低收入地區(qū)廣泛應(yīng)用受到限制。免疫檢測(cè)方法較PCR等技術(shù)更為簡(jiǎn)單、易行，但對(duì)于TBM的診斷準(zhǔn)確度僅處于中等水平，不能鑒別相似神經(jīng)系統(tǒng)疾病，無(wú)法獨(dú)立作為確診TBM的方法。臨床醫(yī)師應(yīng)加深對(duì)TBM臨床表現(xiàn)的了解，掌握相似疾病間的鑒別診斷方法和及早進(jìn)行診斷性抗結(jié)核藥物治療，將有助于快速診斷；實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員應(yīng)重視各種檢測(cè)方法的規(guī)范操作，以利于正確診斷；科研人員應(yīng)注重CSF檢查方法和檢查項(xiàng)目的探索及MTB診斷方法的研究，在積極改進(jìn)現(xiàn)有診斷技術(shù)的同時(shí)探索快速、高效、經(jīng)濟(jì)的新方法，并關(guān)注這種診斷方法的可及性；國(guó)家應(yīng)加大對(duì)高效、準(zhǔn)確診斷MTB方法的支持力度，積極引進(jìn)先進(jìn)技術(shù)并將其納入醫(yī)保，使快速診斷技術(shù)在臨床得以廣泛推廣。