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循環(huán)腫瘤DNA檢測在結(jié)直腸癌臨床診療中的研究進(jìn)展

2019-01-04 04:30王田尹純郭旭邢金良邢延芳
中國癌癥防治雜志 2019年2期
關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)移性靶向耐藥

王田尹純郭旭邢金良邢延芳

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一,在惡性腫瘤中發(fā)病率居第三位,死亡率居第五位[1]。高效的早期篩查方法、準(zhǔn)確的動(dòng)態(tài)評(píng)估策略對(duì)提高結(jié)直腸癌患者治療效果,延長生存期具有關(guān)鍵作用。目前臨床中常使用糞便潛血檢查、CEA等生物標(biāo)志物及影像學(xué)手段進(jìn)行結(jié)直腸癌診斷及監(jiān)測,但難以滿足結(jié)直腸癌防診治全方位的需求,亟待尋找更理想的檢測方法。

近年來,高通量測序技術(shù)迅速發(fā)展,其提供了從分子水平全面認(rèn)識(shí)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的技術(shù)基礎(chǔ)。已有大量基于組織水平的結(jié)直腸癌分子圖譜研究,但臨床組織樣本需經(jīng)過有創(chuàng)操作才可獲得,難以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測。液體活檢是近年來新出現(xiàn)的一種技術(shù),通過在體液樣本中檢測循環(huán)腫瘤 DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTC)等對(duì)腫瘤進(jìn)行監(jiān)測分析。與組織活檢相比,液體活檢具有微創(chuàng)、簡便快捷和克服瘤內(nèi)異質(zhì)性的優(yōu)勢(shì)。ctDNA作為液體活檢的首選,是由腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死或分泌而釋放入外周血的游離DNA,攜帶了腫瘤細(xì)胞的基因變異特征[2]。已有研究證實(shí)結(jié)直腸癌患者ctDNA的突變特征與腫瘤組織DNA具有較高一致性[3]。因此,ctDNA檢測可能取代組織DNA檢測,在結(jié)直腸癌的精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

1 二代測序技術(shù)在ctDNA檢測中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的檢測方法如Sanger測序和定量PCR對(duì)ctDNA檢測的靈敏度非常低,數(shù)字PCR和BEAMing(beads,emulsion,amplification,magnetics)技術(shù)能夠檢測ctDNA中突變頻率低至0.01%的已知突變。與之相比,二代測序(next generation sequencing,NGS)技術(shù)可以檢測所有的癌癥突變并鑒定罕見的基因變異,實(shí)現(xiàn)檢出0.0001%的低頻突變。

NGS是基于邊合成邊測序原理,可一次性對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定的檢測技術(shù)。其中,腫瘤個(gè)性化深度測序(cancer personalized profiling by deep sequencing,CAPP-seq)是一種基于捕獲測序的ctDNA檢測方法。該技術(shù)將優(yōu)化的文庫制備方案與多階段生物信息學(xué)方法相結(jié)合,設(shè)計(jì)了一個(gè)由生物素化DNA寡核苷酸組成的“篩選器”而靶向檢測腫瘤中的常見突變,可檢測到突變頻率低至0.02%的ctDNA,特異性高達(dá)96%[4]。另外,通過引入集成數(shù)字錯(cuò)誤抑制(integrated digital error suppression,iDES),CAPP-seq 檢出 ctDNA的突變頻率可降低至0.004%[5]。選擇性安全測序系統(tǒng)(safe-sequencing system,SAFE-seq)在 PCR擴(kuò)增前將唯一標(biāo)識(shí)符(unique identifier,UID)分配到每個(gè) DNA片段上,最終只有在同一個(gè)UID家族中>95%的PCR片段存在突變時(shí)才被認(rèn)為是突變,可以有效排除擴(kuò)增過程產(chǎn)生的誤差,可檢測突變頻率低至0.0001%的突變。但是,其測序周期相對(duì)較長,DNA不完全擴(kuò)增仍可造成假陽性結(jié)果[6]。此外,標(biāo)記擴(kuò)增深度測序(targeted error correction sequencing,TEC-seq)是一種基于雙標(biāo)記條形碼技術(shù),在基因組多個(gè)區(qū)域靶向捕獲的深度測序方法,其檢測特異性高達(dá)99.9%,靈敏度可達(dá)97.4%。與iDES相比,其假陽性率低于 3×10-7[7]。除了 Illumina平臺(tái),基于半導(dǎo)體的靶向離子流測序(ion semiconductor sequencing)也是一種常見的二代測序技術(shù),可用于ctDNA檢測[8]。

近年來,隨著DNA檢測技術(shù)的飛速發(fā)展,ctDNA的相關(guān)研究受到越來越多關(guān)注。二代測序技術(shù)以其高通量、低成本的優(yōu)勢(shì),使通過檢測ctDNA指導(dǎo)腫瘤臨床診療變得更加切實(shí)可行。然而,最新發(fā)表在JAMA Oncology雜志的一篇文章指出,相同樣品在不同檢測公司的ctDNA檢測結(jié)果一致性僅為35%左右[9]。針對(duì)這些不足,基于ctDNA進(jìn)一步開發(fā)簡單快速、通量高、成本低、靈敏度和特異性更高的檢測技術(shù)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。

2 ctDNA在結(jié)直腸癌患者中的應(yīng)用

2.1 ctDNA在結(jié)直腸癌患者早期篩查中的應(yīng)用

ctDNA在腫瘤發(fā)生時(shí)可以釋放到外周血,因此在早期篩查方面具有良好的應(yīng)用基礎(chǔ)。KOPRESKI等[10]檢測了240例結(jié)直腸癌高危人群的血漿ctDNA,存在Kras突變的64例中有25例確診為結(jié)直腸癌,而無Kras突變的176例中僅有5例最終確診為結(jié)直腸癌,證明了ctDNA中Kras突變可用于評(píng)估人群中結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。CHURCH等[11]研究發(fā)現(xiàn)ctDNA中SEPT9甲基化檢測用于篩查結(jié)直腸癌的靈敏度為48.2%,特異性高達(dá)91.5%。此外,有學(xué)者[12]發(fā)明了一種全新的血液檢測技術(shù)——Cancer SEEK,該技術(shù)可檢測血液中與癌癥相關(guān)的DNA和蛋白質(zhì)。該研究在1 005例被臨床確診的8種常見癌癥(包括結(jié)直腸癌)患者中,發(fā)現(xiàn)Cancer SEEK診斷的靈敏度高達(dá)70%,特異度超過99%,提示ctDNA與傳統(tǒng)血清蛋白標(biāo)志物聯(lián)合檢測可以顯著提高結(jié)直腸癌的檢出率和準(zhǔn)確性。盡管基于ctDNA的結(jié)直腸癌早期篩查策略具有良好的應(yīng)用前景,但由于腫瘤早期階段的ctDNA含量較低,對(duì)檢測技術(shù)要求高[13]。因此,使用ctDNA檢測作為臨床結(jié)直腸癌早期篩查指標(biāo)仍需進(jìn)一步探索。

2.2 ctDNA在結(jié)直腸癌患者動(dòng)態(tài)監(jiān)測及預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用

目前,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)監(jiān)測ctDNA水平有助于判斷腫瘤負(fù)荷,進(jìn)而指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評(píng)估及臨床治療決策。TIE等[14]檢測230例Ⅱ期結(jié)腸癌患者1 046份血漿標(biāo)本中的ctDNA,術(shù)后4~10周血漿可檢出腫瘤特異性突變的14例患者中有11例復(fù)發(fā),164例未檢出的患者中僅16例復(fù)發(fā),說明結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)與術(shù)后ctDNA的檢出顯著相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)直腸癌中ctDNA監(jiān)測較CEA發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提前了6.5個(gè)月[15]。此外,對(duì)于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者,ctDNA檢測可以預(yù)測患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。有研究入組了108例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者,血漿中ctDNA水平低于25%百分位數(shù)的患者疾病控制率為77%,而高于75%百分位數(shù)的患者疾病控制率為30%,證明ctDNA定量可以較好地反映轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的預(yù)后[16]。一項(xiàng)納入1 076例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的Meta分析顯示,較高的ctDNA水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)(HR=2.01,P<1×10-4)[17]。以上研究表明,ctDNA的動(dòng)態(tài)監(jiān)測有助于實(shí)時(shí)判斷腫瘤進(jìn)展,同時(shí)具有較好的預(yù)后評(píng)估價(jià)值。通過檢測ctDNA可對(duì)接受治療的患者進(jìn)一步分類,篩選復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高或預(yù)后較差的患者,以便及時(shí)選擇更有效的治療方案。

2.3 ctDNA在結(jié)直腸癌患者治療選擇及耐藥中的應(yīng)用

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因相關(guān)、多階段進(jìn)展的過程,通過有效抑制或阻斷結(jié)直腸癌的重要驅(qū)動(dòng)基因可以實(shí)現(xiàn)延長患者生存期的目的。靶向治療是結(jié)直腸癌的重要治療方式,然而耐藥機(jī)制的多樣性導(dǎo)致其效果存在較大差異[18]。對(duì)于耐藥位點(diǎn)突變狀態(tài)的檢測,血漿樣本的ctDNA可實(shí)現(xiàn)靶向治療的全程監(jiān)測,明顯優(yōu)于組織樣本。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種酪氨酸激酶受體,與表皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子α結(jié)合后可影響細(xì)胞增殖、凋亡以及周圍血管的形成,發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。KRAS、NRAS、MET、ERBB2等基因突變是常見的導(dǎo)致EGFR單克隆抗體發(fā)生耐藥的原因[19]。KIM等[20]通過NGS技術(shù)檢測接受帕尼單抗治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者ctDNA中RAS的突變情況,發(fā)現(xiàn)238例患者中188例在基線時(shí)為野生型RAS,另外50例是突變型RAS,野生型和突變型RAS患者的中位生存期分別為13.7個(gè)月和7.9個(gè)月,證實(shí)了基線時(shí)ctDNA RAS突變型的結(jié)直腸癌患者接受帕尼單抗治療的結(jié)局較RAS野生型差。此外,EGFR信號(hào)也由PI3K-Akt通路介導(dǎo),而PI3K-Akt通路對(duì)癌細(xì)胞生長和存活至關(guān)重要[21]。XU等[22]對(duì)59例西妥昔單抗耐藥的結(jié)直腸癌患者ctDNA進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變患者的無進(jìn)展生存期明顯低于無突變患者,證實(shí)PIK3CA突變可能是西妥昔單抗重要的耐藥性位點(diǎn)。另外,在一項(xiàng)基于大隊(duì)列結(jié)直腸癌ctDNA的研究發(fā)現(xiàn),單個(gè)患者發(fā)生抗EGFR拮抗劑耐藥可同時(shí)存在KRAS、NRAS、MET等多個(gè)相關(guān)基因突變[23]。

在過去的20年中,新型靶向藥物的開發(fā)和預(yù)測性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)已用于指導(dǎo)患者用藥,使部分轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的生存期明顯延長[24]。然而,受腫瘤異質(zhì)性的限制,結(jié)直腸癌患者選擇治療方案仍較困難。

3 總結(jié)與展望

目前,大量研究表明ctDNA作為潛在生物標(biāo)志物可用于結(jié)直腸癌的早期篩查、實(shí)時(shí)監(jiān)測和預(yù)后評(píng)估等。國內(nèi)外已有成熟的ctDNA檢測試劑盒且被廣泛接受。2016年Septin9甲基化檢測篩查結(jié)直腸癌和基于EGFR基因突變的液態(tài)活檢方法——羅氏Cobas EGFR突變檢測等液體活檢產(chǎn)品獲得美國FDA批準(zhǔn)。2018年2月我國首個(gè)液體活檢產(chǎn)品——Super-ARMS EGFR基因突變檢測試劑盒也通過了CFDA審批。然而,ctDNA在結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值仍需在大規(guī)模的前瞻性試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,ctDNA的應(yīng)用對(duì)全面認(rèn)識(shí)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展提供了重要的支持,隨著測序技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)其臨床價(jià)值的進(jìn)一步探索,ctDNA終將會(huì)在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用,成為結(jié)直腸癌精準(zhǔn)醫(yī)療的重要組成部分。

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