郭遠薇 胡政 羅偉濠 賀榮章 李佳 段麗麗 劉小軍 羅迪賢

乳腺癌是來源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，也是我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。近年來隨著乳腺癌診療手段的改進，其5年生存率明顯升高［1]。上海市乳腺癌臨床醫(yī)學中心的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌患者術后5年生存率從10年前的79.8%提高到89.9%，提高了10.1%。與同一時期國際權威機構報道數(shù)據(jù)比較，美國乳腺癌患者5年生存率從2000年的84.0%提高到2010年的89.0%，上升了5.0%［2-4]，可見帶病生存的晚期乳腺癌患者占比越來越高。乳腺癌廣泛侵襲和轉(zhuǎn)移后未獲得及時有效的診治成為患者死亡的主要原因，因此通過多手段監(jiān)測，及時、有效地發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)以及準確評估疾病進展，有助于進一步延長患者的生存期。

目前諸多的癌癥相關腫瘤標志物研究更著重于癌癥早篩早診，以使患者能在發(fā)病早期通過腫瘤擴大根治手術進行R0切除，從根本上改善患者的預后。然而目前針對乳腺癌早診早篩的大部分研究均未取得實質(zhì)性進展。乳腺癌所有的早期篩查手段雖然可以在一定程度上降低其死亡率，但同時也有一定局限性［4-5]。因此，對于生存率不斷改善的乳腺癌血液循環(huán)標本是諸多人體標本中少數(shù)既滿足微創(chuàng)，又攜帶豐富病情信息的活體標本，是監(jiān)測乳腺癌復發(fā)和病情評估更便捷、高效，且易獲取得的微創(chuàng)手段。循環(huán)腫瘤標志物目前已經(jīng)被廣泛應用于多種惡性腫瘤患者的篩查、診斷、復查、治療效果評估等，本文就循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤DNA（ciculating tumor，ctDNA）和外泌體等循環(huán)腫瘤標志物的生物學特性及其在乳腺癌診療中的應用展開綜述。

1 循環(huán)腫瘤細胞在乳腺癌復發(fā)和預后評估中的應用

近年來研究最多的循環(huán)腫瘤標志物主要有CTCs和ctDNA。CTCs是指實體腫瘤原發(fā)病灶或者轉(zhuǎn)移病灶中脫落的進入血液循環(huán)系統(tǒng)的惡性腫瘤細胞［5]。CTCs在血循環(huán)中數(shù)量較少，但可發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），這使CTCs具有更強的變形和趨化能力，亦加速了腫瘤細胞播散轉(zhuǎn)移的速度［6]。CTCs還具有很強的細胞成團能力，極易發(fā)展成循環(huán)腫瘤微栓（circulating tumor micro-plug，CTM），而 CTM 被認為比 CTCs具有更高的轉(zhuǎn)移潛能力。CTCs還具有一定的自我種植能力，可在腫瘤細胞衍化生成的炎性因子（IL-6、IL-8）的趨化誘導作用下，依靠基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）和肌成束蛋白酶（FSCN1）滲透組織基底層再次回到腫瘤原發(fā)灶，進行克隆性增殖。這一現(xiàn)象解釋了乳腺癌腫塊在完整切除后仍會復發(fā)的原因，可見CTCs是研究乳腺癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的關鍵環(huán)節(jié)［7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞標志物（EMT標志物，如Twist1、Akt2、PI3Kα等）在乳腺癌轉(zhuǎn)移患者中高表達，證明CTCs中存在攜帶腫瘤干細胞特性的亞群，并參與EMT過程［10-11]。此外，該研究還證實CTCs在轉(zhuǎn)換生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路和叉頭框 C1（forkhead box C1，F(xiàn)OXC1）轉(zhuǎn)錄因子信號通路的調(diào)控下參與動態(tài)EMT過程。還有研究報道轉(zhuǎn)移性乳腺癌CTCs攜帶程序性死亡配體-1（programmed cell death-ligand1 PD-L1），是抗 PD-L1 治療的重要靶點［5，12]。2018年全球啟用的AJCC第八版癌癥分期系統(tǒng)，首次將乳腺癌外周血中的CTCs列為預后提示因子，并認為EMT參與了癌癥的轉(zhuǎn)移過程［4]。此外，有研究證實，結(jié)合CTC總數(shù)和間質(zhì)型CTC比例的標準，可用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者治療耐藥性和預后監(jiān)測，同時明確了無進展生存期（PFS）預測聯(lián)合標準：CTC總數(shù)≥10/5 mL、間質(zhì)型CTC比例＞10.7%，符合聯(lián)合標準的患者中位PFS明顯較不符合標準的患者短（6.2個月 vs9.9個月，P=0.010）［13]。以上研究表明CTCs是與乳腺癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關的外周血循環(huán)腫瘤標志物，有望為乳腺癌精準診療提供依據(jù)。

2 ctDNA及其甲基化在乳腺癌復發(fā)與預后評估的應用

ctDNA是指腫瘤患者血液來源的腫瘤細胞壞死、凋亡或者分泌的DNA小片段，長度一般不超過160～180 bp，明顯短于正常細胞內(nèi)的DNA，因此又稱為外周游離血DNA（cfDNA）。腫瘤患者血液中ctDNA含量遠高于健康人，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切［14]。有研究報道ctDNA的腫瘤特性如ctDNA最常見的點突變，使其有利于乳腺癌患者早期預測腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，且發(fā)現(xiàn)p53、PIK3CA、ESR1等乳腺癌相關突變點，但因癌細胞的異質(zhì)性，隨著病情進展突變點也會發(fā)生新的改變［15-16]，由此認為ctDNA與乳腺癌復發(fā)和病情進展有關，且發(fā)生于ctDNA突變可為后續(xù)治療提供新的靶點。因此，ctDNA不僅有利于乳腺癌的病情監(jiān)測，亦可為后續(xù)治療提供決策依據(jù)。

為了驗證ctDNA能否用于監(jiān)測乳腺癌中的微小殘留病灶（minmal residnal disease，MRD），有研究者選取55例接受新輔助化療（new adjuvant chemotherapy，NCT）乳腺癌患者，完成明顯治愈性治療后在單個術后時間點或連續(xù)隨訪樣本中檢測ctDNA，發(fā)現(xiàn)可提高預測其轉(zhuǎn)移復發(fā)的準確性，其中連續(xù)隨訪樣本中的ctDNA檢測提高了復發(fā)預測的靈敏度，中位復發(fā)時間為7.9個月，進一步證明了ctDNA的靶向捕獲測序分析可用于MRD檢測，且MRD測序較原發(fā)癌的測序可更準確地預測后續(xù)轉(zhuǎn)移復發(fā)的發(fā)生發(fā)展，認為ctDNA檢測可以識別具有高復發(fā)風險的乳腺癌患者［15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)在NCT期間，ctDNA水平迅速下降且在手術后未檢測到最小的殘留病灶，而NCT期間ctDNA水平的緩慢下降與較短的存活率密切相關［18]?？傊?，目前研究認為無創(chuàng)突變追蹤外周血中ctDNA可以檢測標準治療后的殘留MRD。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt）作用下將甲基選擇性添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的過程，可調(diào)控基因表達是DNA重要的修飾途徑［19-20]。DNA甲基化是腫瘤發(fā)生過程中較早可觀察到的分子之一，常導致相對應的抑癌基因失去活性，致使腫瘤發(fā)生發(fā)展［21]。血液中ctDNA的含量極少，在微量的ctDNA中檢測單個甲基化難度大，但已有學者將這項技術應用于肝癌檢測［22]。目前關于ctDNA甲基化與乳腺癌的研究相對較少，有研究者在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)分析DNA甲基化可以區(qū)分上皮和間充質(zhì)表型，了解DNA甲基化如何在上皮和間充質(zhì)表型之間變化，有助于更合理地選擇基于甲基化的生物標志物用于循環(huán)腫瘤DNA分析［23]。目前ctDNA越來越多地用于監(jiān)測癌癥治療期間的微小殘留病灶，但ctDNA的檢測依賴于特異性標志物。研究發(fā)現(xiàn)用于評估微小殘留病灶的一些標志物如AKR1B1和APC甲基化對上皮乳腺細胞系具有特異性，而在上皮細胞和間充質(zhì)細胞系中亦均觀察到RASSF1A、RARβ、TWIST1和SFRP2甲基化，這支持了它們對多標記組的適應性［24]，因此開發(fā)類似的方法評估其他標志物監(jiān)測DNA甲基化，可進一步用于乳腺癌的ctDNA檢測。目前乳腺癌ctDNA甲基化研究仍處于早期階段，但早期乳腺癌細胞DNA甲基化以及ctDNA的研究使ctDNA甲基化具備良好的前期基礎，有望在不久的將來用于乳腺癌復發(fā)和晚期病情評估，為乳腺癌晚期患者提供新的治療靶點。

3 外泌體在乳腺癌復發(fā)與預后評估的應用

外泌體（Exosome）是指經(jīng)由細胞內(nèi)的囊泡運輸，從多泡體（multivesicularbody，MVB）排出到細胞外的直徑為30～100 nm的細胞外囊泡，在人體中可分布于血液、體液、唾液、乳汁、腦脊液等［25]。外泌體包含了miRNA、lnRNA、cirRNA、DNA以及蛋白質(zhì)等分子，且與細胞的功能狀態(tài)關系密切。此外，外泌體在生物學過程、疾病治療和診斷中扮演著重要角色，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中亦起著重要作用，近幾年外泌體被證實參與調(diào)控細胞表面蛋白以及多條細胞通路，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的傳導。而對于非哺乳期的乳腺癌患者而言，血清外泌體最易于獲取且其外泌體內(nèi)含物與患者病情密切相關。有研究表明，乳腺癌細胞外泌體囊泡內(nèi)的蛋白質(zhì)（CD39、CD73及TGF-β）和 miRNA（miR-122、miR-10b、miR-222及 miR-105）參與了乳腺癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移等過程［26]。RICHES 等［27]研究發(fā)現(xiàn)正常乳腺上皮細胞及乳腺癌細胞外泌體的分泌是互為作用的反饋調(diào)節(jié)，即正常乳腺上皮細胞分泌的外泌體會抑制乳腺癌細胞分泌，反之亦然，提示密切檢測乳腺癌外泌體的變化可以有效及時地觀察乳腺癌治療療效以及評估復發(fā)風險。近年來非編碼RNA（miRNA、lnRNA、cirRNA）為惡性腫瘤研究的熱點領域，已有研究明確了非編碼RNA與腫瘤細胞分型、分化程度和預后的關系［25]。而絕大多數(shù)與腫瘤相關的非編碼RNA研究均需要取得新鮮的腫瘤標本，血清外泌體則為非編碼RNA的研究提供了更便捷的方法。事實上隨著惡性腫瘤的發(fā)生和進展，血清外泌體中的非編碼RNA、DNA和蛋白質(zhì)含量和種類均會發(fā)生相應變化。因此，血清外泌體也是乳腺癌復發(fā)監(jiān)測和晚期病情評估的有效途徑，但仍需進一步研究篩選靈敏度和特異度更高的標志物，以獲得更為精準的評估參數(shù)。

4 腫瘤血小板在乳腺癌復發(fā)與預后評估中的應用

腫瘤血小板（tumor-educated platelets，TEPs）是一類含有與正常血小板不同RNA特殊血小板，可與腫瘤細胞發(fā)生相互作用［28]。TEPs是最近新發(fā)現(xiàn)的可作為腫瘤RNA的生物標志物，被認為參與腫瘤生長的全身和局部反應。TEPs參與多種實體瘤的進展和擴散，且TEPs RNA的剪接突變提示腫瘤的發(fā)生、發(fā)生部位和分子特征的特定信息［29-30]。目前，已有學者對來自不同腫瘤類型（包括肺癌、腦癌和乳腺癌）患者的TEPs樣本進行測試，結(jié)果顯示腫瘤患者的TEPs與良性病變和其他非癌性疾病患者的TEPs不同［31-32]。但尚未清楚血小板如何“腫瘤化”，仍需進一步探索導致血小板內(nèi)部RNA剪接的機制，以及特定血小板亞群之間相互變化與癌癥病情的相關性。有研究者通過283個血小板樣品的mRNA測序確定了TEPs與腫瘤的相關性，該研究對比了55名健康對照和228例有局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移腫瘤患者的TEPs，腫瘤復發(fā)預測準確率達96%，且發(fā)現(xiàn)在6種不同腫瘤類型中，原發(fā)腫瘤位置被正確識別，準確率為71%［27，29]。該研究結(jié)果表明，腫瘤血小板與腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移、多發(fā)原位癌發(fā)生發(fā)展均有關，可能成為“液體活檢”的一部分，而用于乳腺癌的復發(fā)和晚期病情評價。

5 小結(jié)

乳腺癌的傳統(tǒng)預后和復發(fā)預測指標包括雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和原癌基因人類表皮生長因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）等，基于此及乳腺癌分子分型，可幫助患者選擇內(nèi)分泌治療和靶向HER2治療。但是以上方法存在取材次數(shù)，檢測方法以及診斷主觀性強等缺點。乳腺癌病情進展往往從微轉(zhuǎn)移開始，檢測乳腺癌患者微轉(zhuǎn)移狀態(tài)有助于早期定位復發(fā)及轉(zhuǎn)移的高危人群，對加強患者隨訪、采取相應治療措施、減少腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移及提高患者生存率具有重大意義［33]。骨髓中微轉(zhuǎn)移細胞即彌散腫瘤細胞雖然對乳腺癌患者具有獨立的預后預測價值，但需要進行侵入性較大的骨髓穿刺。而循環(huán)腫瘤標志物（包括CTCs、ctDNA、ctDNA甲基化、外泌體以及TEP）檢測取材創(chuàng)傷小，且可同時檢測的標志物種類較多，提供的病情信息更全面。長久以來，TNM分期是乳腺癌病情評估和預后判斷的依據(jù)，也是患者手術指征的主要判斷標準。近年來隨著乳腺癌患者5年生存率不斷提高，TNM分期中晚期帶瘤生存的患者越來越多，而這些患者中部分患者的預后與TNM分期出入較大，因此有必要進一步引入分子生物學分期。未來應對循環(huán)腫瘤標志物深入研究，將每一個循環(huán)腫瘤標志物與乳腺癌患者的生存期和預后的關系進行大樣本調(diào)查，以獲取更豐富的數(shù)據(jù)，從而制定更精準的分期標準。而精確的分子生物學分期標準結(jié)合經(jīng)典的TNM分期，有望為乳腺癌患者制定更符合其病情的診斷和分期標準，從而更精確評估患者復發(fā)和晚期病情制定個體化治療方案。

綜上所述，循環(huán)腫瘤標志物在乳腺癌復發(fā)監(jiān)測和晚期病情評估中有著良好的應用前景，同時一些循環(huán)腫瘤標志物的突變位點變化有望為乳腺癌的治療提供新的靶點，以及為乳腺癌患者個體化治療提供更多循證依據(jù)。但是目前外周血腫瘤循環(huán)標志物高昂的檢測費用，很大程度上限制了它在臨床的應用，循環(huán)腫瘤標志物與乳腺癌病情的關系，以及操作更簡便、成本更低廉的檢測方法仍需進一步研究，以改善晚期帶瘤生存患者的生存質(zhì)量。