薛艷 李英 諶國鵬 張星 陳喬 何忠軍 王風(fēng)敏 李虎

摘要：為揭示高油甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源的遺傳背景，明確各材料間的遺傳距離，加快陜南地區(qū)高油育種進程，利用20對甘藍(lán)型油菜首選的簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）核心引物，對陜南地區(qū)65份含油量達(dá)40.58%～53.52%的甘藍(lán)型油菜育種材料進行遺傳多樣性分析，利用NTSYS-pc1.10e計算材料間多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC），并用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）對材料進行聚類分析。結(jié)果表明，從20對SSR核心引物中共篩選出7對最佳引物，平均每對引物檢測到7個條帶。供試材料的PIC值分布在0.33～0.86范圍內(nèi)，平均值0.58。聚類分析結(jié)果表明，在相似系數(shù)為0.54處將65份供試材料劃分為兩大類群。供試材料的遺傳距離較近，不利于陜南地區(qū)高油甘藍(lán)型油菜的育種工作。加強種質(zhì)創(chuàng)新，引進外來優(yōu)良種質(zhì)資源并加以改造利用是提高陜南地區(qū)高油甘藍(lán)型油菜育種水平的根本途徑。

關(guān)鍵詞：SSR標(biāo)記;高含油量;甘藍(lán)型油菜;遺傳多樣性;種質(zhì)資源

中圖分類號： S565.403文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0124-04

收稿日期：2019-02-21

基金項目：陜西省重點研發(fā)計劃（編號：2017ZDXM-NY-006）。

作者簡介：薛艷（1982—），女，陜西漢中人，碩士，農(nóng)藝師，主要從事油菜分子育種研究。E-mail：791477005@qq.com。

通信作者：李英，研究員，主要從事油菜遺傳育種研究。E-mail：liying3315@163.com。

油菜是重要的油料作物之一，2017—2018年我國油菜種植面積高達(dá)720萬hm2。目前長江流域是我國油菜主產(chǎn)區(qū)，其種植面積占全國總量的70%，種植類型以甘藍(lán)型油菜為主。甘藍(lán)型油菜是蕓薹和甘藍(lán)的種間雜交復(fù)合種[1]，起源于歐洲，其雜種優(yōu)勢明顯，在產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性方面都較常規(guī)種具有顯著優(yōu)勢。由于地域因素及起源歷史較短等原因，甘藍(lán)型油菜在我國的遺傳背景比較狹窄，基因資源的不足限制了雜種優(yōu)勢的有效利用。油菜的高含油量一直是重要的育種目標(biāo)之一，油菜種子含油量的高低直接關(guān)系到單位面積的產(chǎn)油量。早在20世紀(jì)蘇聯(lián)科學(xué)家就曾預(yù)言，油菜種子的含油量有望達(dá)到60%，現(xiàn)在這一目標(biāo)已經(jīng)實現(xiàn)并有所突破，我國新審定油菜品種的含油量也有了大幅度提升[2]。高含油量油菜品種的選育基礎(chǔ)是高油種質(zhì)資源，而雜種優(yōu)勢的利用是實現(xiàn)高含油量育種目標(biāo)的重要途徑[3]。將遺傳多樣性分析應(yīng)用到油菜高含油量育種資源篩選中，可以明確材料間的親緣關(guān)系和遺傳距離，對油菜高含油量育種中的親本選配進行指導(dǎo)，可有效提高育種效率，同時還能為改良現(xiàn)有高含油量材料提供參考。因此，對油菜高含油量種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，對于育種材料的發(fā)掘利用和新品種的選育具有重要意義[4]。

隨著DNA分子標(biāo)記方法的建立，從分子水平上揭示品種之間的遺傳變異已成為當(dāng)今作物育種家們的研究重點。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記具有數(shù)量豐富、覆蓋整個基因組且分布均勻、多態(tài)性高、穩(wěn)定性高、試驗操作技術(shù)簡單等優(yōu)點。已有大量研究證明，SSR標(biāo)記能夠檢測不同油菜種質(zhì)資源的特異性，有效指導(dǎo)種質(zhì)資源的有效利用，因此成為研究油菜遺傳多樣性的有效方法[5]。

在進行遺傳多樣性分析時，引物的篩選是整個試驗非常關(guān)鍵的步驟。李海渤等利用100份具有代表性的甘藍(lán)型油菜品種（系）從746對SSR引物中進行篩選，通過綜合考量，最終確定44對引物為甘藍(lán)型油菜核心引物，其中20對引物為首選核心引物，24對引物為備選核心引物[6]。本試驗從20對首選核心引物中再次篩選出7對最佳引物，對漢中地區(qū)目前主要利用的甘藍(lán)型油菜高含油量育種材料的遺傳背景進行全面分析，以期為改良育種材料和選育新高含油量品種提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料由漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所油菜研究室提供，總共65份，其中有50.8%的材料是該所自育材料。在所有材料中，含油量在40%～45%之間的共23份，在45%～50%的共32份，還有10份材料的含油量在50%以上，屬于特高含油量油菜（表1）。

1.2試驗方法

1.2.1樣品DNA提取采用十二烷基苯磺酚鈉（SDS）法[7]提取油菜基因組DNA。

1.2.2DNA檢測油菜基因組DNA采用0.8%瓊脂糖凝膠進行檢測，電泳條帶越清晰DNA質(zhì)量越高。

1.2.320對SSR引物序列的PCR擴增參照甘藍(lán)型油菜首選核心引物（表2）[6]?從中篩選出具有較高多態(tài)性的引物

加以利用。PCR反應(yīng)體系：2×Taq master MIX 7.5 μL，10 μmol/L 的正反引物各1 μL，50 ng/μL DNA模板1.0 μL，ddH2O 4.5 μL，反應(yīng)總體積15 μL。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，10個循環(huán)，每循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃;94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.4凝膠電泳采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，電壓為150 V，電泳時間為1.5 h。

1.2.5染色電泳完成后，用硝酸銀染色顯帶，具體包括8個步驟：固定→水洗→染色→快速漂洗→顯影→停顯→漂洗→ 保存[7]。

1.2.6凝膠攝影將完成顯色的凝膠放到凝膠成像儀中在白光下拍照。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計時將清晰的條帶記作“1”，無條帶記作“0”，缺失條帶記作“9”，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc2.10e系統(tǒng)軟件中的相似性系數(shù)（DICE）法計算材料間的遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）進行遺傳聚類分析并繪制聚類樹狀圖。多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）采用Smith等報道的方法[8]計算，PIC值能夠準(zhǔn)確反映出每對SSR引物區(qū)分材料的能力。其計算公式為PIC=1-∑nj=1P2ij。式中：PIC表示位點i的PIC值;Pij表示位點i的第j個等位位點出現(xiàn)的頻率，位點i的帶型為1～n;PIC為0～1，0代表位點無多態(tài)性，1代表位點具有多個等位位點。每個標(biāo)記的多態(tài)性程度用多態(tài)性含量指標(biāo)衡量，當(dāng)PIC>0.50時，該基因座為高度多態(tài)基因座，025≤PIC≤0.50時為中度多態(tài)基因座，PIC<0.25時為低度多態(tài)基因座[9]。

2結(jié)果與分析

2.1SSR標(biāo)記的擴增片段多態(tài)性

如表3所示，從20對油菜核心引物中再次篩選得到7對穩(wěn)定、擴增效果好、多態(tài)性豐富、不同材料之間差異明顯的SSR引物，這7對SSR引物在65個不同含油量油菜材料中共檢測出49個等位變異，單個SSR引物檢測到的等位變異數(shù)介于4～11之間。其中引物CB10028擴增的等位變異數(shù)最多，為11個（圖1），而引物CB10587最少，僅4個。

每個SSR位點的多態(tài)性含量指數(shù)在0.33～0.86之間，平均值為0.58，說明篩選出的引物具有較強的材料區(qū)分能力，這7對SSR引物的帶型組合能夠準(zhǔn)確區(qū)分65份供試材料。用這些SSR標(biāo)記研究的65份油菜材料的遺傳多樣性處于中高度多態(tài)水平，其中通過引物CB10587檢測到的位點遺傳多樣性最高，達(dá)到0.86，而通過CB10036檢測到的位點遺傳多樣性最低，只有0.33。

2.2聚類分析

如圖2所示，在相似系數(shù)為0.54處，65份供試材料被劃分為兩大類群。第1類群包括53個材料，第2類群包含12個材料。兩大類群又各自被劃分為2個亞組，第1類群的第1亞組包括312A、浙50等43個材料，其中青雜3A-B和CYZ0201FR的遺傳相似系數(shù)最高，達(dá)到0.90;第1類群的第2亞組包括漢3A、中11/中821核選等10個材料。第2類群的第1亞組包括09-4082-1、DW-4R等10個材料，其中9816/中4A/HSTC5//D4R///F2-2FR和H16A/R11R遺傳相似系數(shù)最高，達(dá)到0.92;第2亞組只有N58A-B-R和H6R這2個材料。本試驗中材料來源較豐富，根據(jù)材料來源來看，來自同一個地區(qū)或相鄰地區(qū)的材料遺傳相似系數(shù)較高，在聚類圖中也明顯聚在一起。如分別來自安徽、湖北、湖南和江蘇的材料H82J24、Z2R、HSC4R、X98R和楊4在聚類圖中就分到同一類中，而來自四川和陜西的材料也多分布于同一類中，而且它們的含油量也比較接近。從聚類圖中還可以看出，有相同親緣的材料也都是最先聚在一起，如中11-1/浩11和中11/青雜早。

為了檢驗試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，所有試驗材料都隨機編號，對幾個親緣關(guān)系相近的材料編不同序號，另外在同一材料上取2份樣品標(biāo)記不同編號。從試驗結(jié)果來看，最先聚在一起都是親緣關(guān)系最近的材料，如雜03-92-1和雜03-92-2、H105FR和H109FR、Q11R和Q10R以及中4A/HSTC5//D4R///F1-1和中4A/HSTC5//D4R///F2-2FR，說明本試驗結(jié)果科學(xué)可靠，用SSR分子標(biāo)記對油菜種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，可以準(zhǔn)確地掌握材料間的遺傳背景和親緣關(guān)系。根據(jù)本試驗結(jié)果，可以將遺傳距離較遠(yuǎn)的高含油量不育系和恢復(fù)系進行配置組合，如漢3A（46.91%）和中11/青雜早（5352%）或者Z11A（47.82%）和浙50選系（50.98%）;也可以將遺傳距離較遠(yuǎn)的高含油量恢復(fù)系進行雜交，以提高其含油量，如2061FR（52.55%）和H6R（43.37%）、S12R（4885%）和DW-4R（48.13%），而這些新組合在實際生產(chǎn)中是否具有較強的雜種優(yōu)勢、具備更高的含油量還有待進一步研究。

3討論與結(jié)論

目前油菜新品種選育以雜交育種為主，利用雜種優(yōu)勢是提高油菜產(chǎn)量和品質(zhì)最有效的途徑[10]。陜西省的雜交油菜育種水平位居全國前列，世界上第1個雜交油菜品種秦油2號就是在陜西省育成的。漢中地區(qū)不僅是陜西省油菜生產(chǎn)的最佳適生區(qū)，也是全國范圍內(nèi)油菜種植最佳適生區(qū)之一，油菜制種水平較高。漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所開展了油菜分子育種方面的研究，分子輔助育種技術(shù)在新品種的選育中發(fā)揮了積極作用。近年來，漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所已有4個品種通過陜西省審定登記，其中漢油8號還通過了國家審定，且通過審定的油菜品種的含油量已大幅度提高，如已審定的新品種漢油1618，其含油量高達(dá)46.04%，其親本在本研究中分屬于兩大不同的雜種優(yōu)勢群，親本的含油量都在45%以上，遺傳距離較遠(yuǎn)。另外表現(xiàn)優(yōu)異正在登記的新品種漢油1418和漢油10號，其親本含油量都較高，在本研究中也分屬于不同類群且遺傳距離較遠(yuǎn)。說明在一定范圍內(nèi)?油菜高含油量親本材料的遺傳距離越大，雜種優(yōu)勢越強，選育出的品種含油量較高，這與前人的研究結(jié)果[11]一致。

核心引物的概念源于核心種質(zhì)。核心種質(zhì)是指最小數(shù)量的種質(zhì)資源最大限度地代表整個資源的多樣性。而核心引物是用最少數(shù)量的引物最大限度地檢測基因型，節(jié)約大量的引物篩選時間，從而提高檢測效率，降低成本[12]。本試驗篩選了7對核心引物，將供試65份油菜高油材料進行了準(zhǔn)確分析。這些材料的遺傳相似系數(shù)分布在0.54～0.92之間，說明供試材料的遺傳相似度較大，遺傳背景較為狹窄。遺傳基礎(chǔ)狹窄主要是因為各個育種單位的育種目標(biāo)相同，對已有的高含油量育種材料的交流和使用太過頻繁。加強種質(zhì)創(chuàng)新研究，擴大對外來優(yōu)良種質(zhì)資源的引進和利用研究，是目前提高漢中地區(qū)油菜高含油量育種水平的重要途徑[11]。分子標(biāo)記是進行遺傳多樣性分析最有效的工具，將SSR分子標(biāo)記應(yīng)用到育種工作中，通過分析各親本的親緣關(guān)系與遺傳距離，指導(dǎo)雜交育種和優(yōu)勢組合選配，加強目標(biāo)育種的親本選配效果，將更有利于加快育種進程，選育出具有更高含油量的突破性品種。

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