呂丹丹 何 佳 宋文華 袁江月

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

鳳丹(Paeoniaostii‘Feng Dan’) 又名銅陵牡丹，為芍藥科芍藥屬植物，主要產(chǎn)于安徽銅陵，于2006年被中國(guó)質(zhì)檢總局列為“國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”[1]。牡丹花具有較高的藥用價(jià)值[2]。2013年丹鳳牡丹花被中國(guó)衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)為新食品原料[3]。鳳丹作為油用牡丹，各地均有大量種植，生產(chǎn)中為了提高結(jié)籽率，需要大量疏花。牡丹花中含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括多酚類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物、維生素、多種礦物質(zhì)等[4]，以及類黃酮類物質(zhì)，具有良好的抗氧化作用。

目前已有關(guān)于乳酸菌發(fā)酵對(duì)植物酚類物質(zhì)和抗氧化性影響的報(bào)道，如：Cagno等[5]研究發(fā)現(xiàn)，混合果蔬汁發(fā)酵后，能防止果蔬汁酚類物質(zhì)的降解，維持了其抗氧化活性；Tabasco等[6]發(fā)現(xiàn)，葡萄籽經(jīng)乳酸菌發(fā)酵可增加其沒食子酸的含量；鄭欣等[7]研究發(fā)現(xiàn)，腸膜狀明串珠菌相比其他菌發(fā)酵后，總酚和色差保留率高。但這些研究都未對(duì)發(fā)酵后單體酚類物質(zhì)的變化進(jìn)行研究。馬利華等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵槐花后，其營(yíng)養(yǎng)性和抗氧化能力均有所提高；Park等[9]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌發(fā)酵旋覆花花瓣后，總黃酮含量得到了提高。但這些研究都集中在單種菌發(fā)酵后物質(zhì)的變化。韓雪等[10]發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌發(fā)酵紅棗漿后，游離態(tài)酚含量和抗氧化能力優(yōu)于其他菌種；Liu等[11]研究也表明，乳酸菌發(fā)酵諾麗果汁，可以增強(qiáng)其抗氧化能力。但都未研究發(fā)酵后抗氧化與色差間的聯(lián)系。目前關(guān)于不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)鳳丹花瓣酚類物質(zhì)、色差和抗氧化能力影響的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)擬以鳳丹花瓣為原料，選用8種乳酸菌發(fā)酵后，根據(jù)總酚、總黃酮含量、色差值和抗氧化能力的變化，篩選出最適的菌種，并采用高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵后單體酚變化進(jìn)行了分析，以期為研發(fā)出一種新型的鳳丹花乳酸菌發(fā)酵飲料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鳳丹白花瓣：洛陽(yáng)洛寧；

檸檬酸：食品級(jí)，河南興源化工產(chǎn)品有限公司；

β-環(huán)糊精：食品級(jí)，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；

果葡糖漿：上海根萊食品有限公司；

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，HZLp-005)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，HZLc-017)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus，HZLh-003)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，HZLb-006)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，HZSt-012)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，HZLr-023)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，HZLa-008)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei，HZLp-019)：實(shí)驗(yàn)室保藏；

蘆丁、沒食子酸、芍藥苷、對(duì)香豆酸、根皮苷、木犀草素、槲皮素、山萘酚：標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；

福林酚試劑：上海源葉生物科技有限公司；

VC：分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基：上海藍(lán)季生物有限公司；

MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋：HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

pH計(jì)：PHS-25型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KB型，上海申安醫(yī)療器械廠；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250型，北京市永光明醫(yī)療儀器公司；

離心機(jī)：TG16-W型，河南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

分光光度計(jì)：UV-2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

全自動(dòng)色差計(jì)：SC-80C型，北京康光光學(xué)儀器有限公司；

高效液相色譜儀：1260型，美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 分別將8種乳酸菌置于MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)壯，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。

1.2.2 鳳丹白花瓣浸提液制備 鳳丹花瓣清洗干凈后，切碎(3～5 mm)，加入15倍質(zhì)量的去離子水打漿，添加護(hù)色劑(0.03% 檸檬酸、0.02%β-環(huán)糊精)于漿液中，65 ℃水浴1 h。浸提結(jié)束后，加入6%果葡糖漿，取100 mL分裝于250 mL三角瓶中，100 ℃滅菌15 min。

1.2.3 鳳丹白花瓣浸提液發(fā)酵培養(yǎng) 滅菌后的鳳丹白花瓣浸提液，冷卻，置于無菌操作臺(tái)上，分別取 3 mL 乳酸菌發(fā)酵劑(菌濃度：8.0～9.0 CFU/mL)，5 000 r/min離心 10 min，棄上清，加入3 mL 滅菌的生理鹽水重懸乳酸菌，接入滅菌的鳳丹花瓣浸提液中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清。

1.2.4 總黃酮含量的測(cè)定 亞硝酸鈉—硝酸鋁法[12]。

1.2.5 總酚含量的測(cè)定 福林酚試劑法[13]。

1.2.6 色差的測(cè)定 參考Rui等[14]的方法采用全自動(dòng)色差計(jì)(透射模式)對(duì)發(fā)酵鳳丹花浸提液樣品的色澤進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 單體酚含量的測(cè)定 參考陳智毅等[15]方法，采用高效液相色譜儀。色譜柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：水，流動(dòng)相 B：乙腈；洗脫順序：0～25 min，30%～60% B，25～30 min，30% B。柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230，280，360 nm；流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。制作不同濃度的單體酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上；標(biāo)準(zhǔn)品回收率為 94%以上，測(cè)定重復(fù)3次。根據(jù)保留時(shí)間及峰面積計(jì)算樣品中單體酚含量。

1.2.8 鳳丹花乳酸發(fā)酵液體外抗氧化活性測(cè)定

(1) DPPH自由基清除率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[16]；

(2) ABTS自由基清除率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]；

(3) 還原力的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)總酚和總黃酮的影響

由表1可以看出，與發(fā)酵前相比，5種乳酸菌發(fā)酵鳳丹花浸提液后，其總酚含量得到了提高，增加幅度為0.20%～4.95%，其中植物乳桿菌發(fā)酵后總酚含量顯著增加(P<0.05)，增加量為4.95%。總酚含量增加排序?yàn)椋褐参锶闂U菌>嗜酸乳桿菌>保加利亞乳桿菌>干酪乳桿菌>嗜熱鏈球菌。通過8種乳酸菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌發(fā)酵釋放酚的能力不同。李俶等[19]研究發(fā)現(xiàn)酚類含量的提高可能是乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生了某些酶類，對(duì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行了水解，進(jìn)而使細(xì)胞中的一些酚類物質(zhì)釋放出來。植物乳桿菌相比其他菌，發(fā)酵后總酚含量顯著提高，可能是其在發(fā)酵過程中使更多的糖基化酚類去糖基化，從而使植物細(xì)胞壁中可溶性酚釋放[20]。Wouters 等[21]通過復(fù)合乳酸菌發(fā)酵韭菜，也發(fā)現(xiàn)了其游離酚得到了提高。Wu等[22]通過3種不同乳酸菌發(fā)酵石蓮花后，發(fā)現(xiàn)游離酚含量得到了不同程度的提高，以植物乳桿菌發(fā)酵后游離酚含量提高最多。這些與本研究結(jié)果一致。

與發(fā)酵前相比，6種乳酸菌發(fā)酵后總黃酮含量得到了提高，增加幅度為0.64%～12.51%，其中保加利亞乳桿菌和植物乳酸菌發(fā)酵后總黃酮含量顯著增加(P<0.05)。植物乳酸菌發(fā)酵后黃酮含量提高了12.51%，保加利亞乳桿菌發(fā)酵后黃酮含量提高了7.69%?？傸S酮增加量按大小排列為：植物乳桿菌>保加利亞乳桿菌>鼠李糖乳桿菌>瑞士乳桿菌>干酪乳桿菌>嗜酸乳桿菌。黃酮含量的提高明顯比總酚含量的顯著，可能是復(fù)雜的多酚在發(fā)酵過程中被一些酶分解，變成了更簡(jiǎn)單的黃酮醇類化合物等[23]。其中植物乳桿菌發(fā)酵后，總酚含量和總黃酮含量都顯著提高(P<0.05)。

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 對(duì)單體酚的影響

單體酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表2。由表3可以看出，鳳丹中蘆丁和槲皮素是含量較多的2種單體酚；而木犀草素、對(duì)香豆酸、芍藥苷、根皮苷和山奈酚的含量較低。乳酸菌發(fā)酵鳳丹花浸提液后，大部分單體酚含量都有所降低，不同乳酸菌發(fā)酵鳳丹花浸提液后單體酚變化也不同。僅保加利亞乳桿菌發(fā)酵后蘆丁、槲皮素得到了顯著提高(P<0.05)，其中蘆丁提高了3.16%，槲皮素提高了0.81%。其他7種乳酸菌，植物乳酸菌發(fā)酵后蘆丁含量下降最少，為4.84%；嗜酸乳桿菌發(fā)酵后槲皮素含量下降最少，為5.47%。

在除了保加利亞乳桿菌外，其他7種乳酸菌發(fā)酵后，芍藥苷含量顯著降低(P<0.05)，下降幅度為7.42%～83.20%。對(duì)香豆酸在發(fā)酵后含量都顯著降低(P<0.05)，下降幅度為9.41%～44.10%。木犀草素的含量，僅瑞士乳桿菌發(fā)酵后含量增加，但不顯著，其他下降幅度為4.29%～8.50%。而根皮苷經(jīng)發(fā)酵后含量變化較大，嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌發(fā)酵后均未檢測(cè)到，植物乳桿菌發(fā)酵后含量顯著提高(P<0.01)，增加了78.37%。山奈酚在發(fā)酵前未檢測(cè)到，經(jīng)保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵后都有檢測(cè)到，其中保加利亞乳桿菌發(fā)酵后含量最多。

以上結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵對(duì)鳳丹花浸提液中的單體酚含量和組成都有影響。其中保加利亞乳桿菌發(fā)酵后，蘆丁、槲皮素、芍藥苷和山奈酚含量都有一定的提高；植物乳桿菌發(fā)酵后，根皮苷、山奈酚含量提高。Kwaw等[24]用乳酸菌發(fā)酵桑葚汁后，蘆丁、槲皮素含量顯著增加。Bisakowski等[25]用植物乳桿菌對(duì)紅洋蔥發(fā)酵后，能使槲皮素二糖苷降解成槲皮單糖苷。Dueas等[26]研究表明，植物乳桿菌發(fā)酵豇豆后，游離態(tài)槲皮素含量增加，與本研究相似。研究[27]表明，乳酸菌發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的多酚氧化酶對(duì)高分子量復(fù)合酚進(jìn)行了解聚。pH的降低可以穩(wěn)定一些酚類[28]，因此在較低pH浸提液中總酚含量高。在較低的pH范圍內(nèi)，酚類物質(zhì)的提取量增加[29]。保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸能力較弱，發(fā)酵液pH值較高，穩(wěn)定酚類能力較弱，因此發(fā)酵后總酚含量沒有植物乳桿菌高，但其單體酚含量多。

表2 單體酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

表3 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)鳳丹花浸提液中單體酚的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)；ND表示沒有檢測(cè)到。

2.3 對(duì)色澤的影響

如表4所示，8種乳酸菌發(fā)酵對(duì)浸提液的亮度影響顯著(P<0.05)，L*值均降低。除植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和干酪乳桿菌外，其他乳酸菌發(fā)酵b*值均降低；除鼠李糖乳桿菌外，其他乳酸菌發(fā)酵a*值均增加。付磊等[30]研究發(fā)現(xiàn)鳳丹白中幾乎不含花青素，故其浸提液顏色淡黃。發(fā)酵后浸提液L*值的降低最為顯著的是植物乳桿菌(P<0.05)，而其發(fā)酵后總酚、總黃酮最高，說明之間存在關(guān)系。如表5所示，L*值與總酚、總黃酮含量顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。Lago-Vanzela等[31]研究發(fā)現(xiàn)a*值與總酚和總黃酮含量有關(guān)，證實(shí)了表5中a*值與總酚極顯著相關(guān)關(guān)系(R2=0.806 5)。b*值與總黃酮含量顯著正相關(guān)(R2=0.761 4)，與總酚含量也正相關(guān)(R2=0.717 8)，表明總酚、總黃酮含量與b*值也有一定關(guān)系。研究[32]表明，當(dāng)總色差△E>2時(shí)，樣品的色澤變化可以通過肉眼觀測(cè)，即樣品間的色澤發(fā)生了顯著的變化。8種乳酸菌發(fā)酵，其中植物乳桿菌△E值變化顯著(P<0.01)，且>2，表明植物乳桿菌發(fā)酵后，浸提液顏色變化較大。

表4 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)鳳丹花浸提液色差的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表5 總酚、總黃酮與色差的相關(guān)系數(shù)表?

? “**”表示P<0.01，差異極顯著；“*”表示P<0.05，差異顯著。

2.4 對(duì)抗氧化活性的影響

由表6可以看出，鳳丹花浸提液經(jīng)干酪乳桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵后，DPPH自由基清除率與發(fā)酵前相比顯著提高(P<0.01)，增加幅度為4.53%～11.14%。瑞士乳桿菌發(fā)酵后清除率增加不顯著，增加了1.25%。DPPH在溶液中可以形成一個(gè)穩(wěn)定的含氮自由基，抗氧化劑等加入后，通過傳遞電子或質(zhì)子而生成穩(wěn)定的分子狀態(tài)DPPH2，乳酸菌發(fā)酵可能會(huì)生成一些含有遞質(zhì)子能力的化合物，從而使清除率升高[33]。由表7可知，DPPH自由基清除率與總酚、總黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系(R2分別為0.992，0.797)。 與發(fā)酵前相比，干酪乳桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵后，ABTS自由基清除率都得到了提高，增加幅度為2.47%～6.58%，僅植物乳桿菌發(fā)酵后清除率得到了顯著提高(P<0.05)，為6.58%。ABTS自由基清除率與總酚、總黃酮含量也呈正相關(guān)關(guān)系(R2分別為0.831 4，0.836 9)。

植物乳桿菌發(fā)酵后，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和還原力分別增加了11.14%，6.58%，16.19%；保加利亞乳桿菌發(fā)酵后，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和還原力分別增加了4.53%，2.47%，6.07%。這些與2種菌發(fā)酵后總酚、總黃酮含量高是一致的。

酚類化合物抗氧化能力的不同可能是其芳香環(huán)上所帶羥基數(shù)量的不同引起的，因此根據(jù)溶液中所含酚類化合物種類和含量的差異，抗氧化活性也可能不同[34]。這些也都證實(shí)了，DPPH、ABTS自由基清除能力和還原力與總酚、總黃酮之間的高相關(guān)性關(guān)系。從單體酚含量分析，僅保加利亞乳桿菌發(fā)酵后，蘆丁和槲皮素含量增加，而植物乳桿菌發(fā)酵后下降量也是最少的，這與2種菌發(fā)酵后高抗氧化能力存在一定聯(lián)系。Bisakowski等[25]用植物乳桿菌對(duì)紅洋蔥發(fā)酵后，槲皮素二糖苷下降，而槲皮單糖苷增加，后者具有比前者更高的抗氧化活性。由此可見，乳酸菌發(fā)酵導(dǎo)致酚類物質(zhì)間的相互轉(zhuǎn)化，能明顯改變其抗氧化性。

表6不同乳酸菌發(fā)酵前后的抗氧化性與VC的抗氧化性的比較?

Table 6 Comparison of anti-oxidation and anti-oxidation of VCbefore and after fermentation of different lactic acid bacteria

菌種DPPH/%ABTS/%還原力(OD值)發(fā)酵前80.23±0.45cd56.05±1.20bc0.247±0.04f干酪乳桿菌88.23±1.00a57.43±1.57b0.267±0.04c嗜熱鏈球菌76.56±0.67e54.47±0.46de0.252±0.05ef保加利亞乳桿菌83.86±0.47b57.05±0.79b0.262±0.04cd植物乳桿菌89.16±0.47a59.71±0.66a0.287±0.03a鼠李糖乳桿菌79.76±0.61d55.43±0.65dce0.250±0.04f瑞士乳桿菌81.23±0.31c54.04±0.59e0.259±0.03de嗜酸乳桿菌79.33±1.08d55.95±1.43bcd0.278±0.05b副干酪乳桿菌77.40±0.46e51.62±0.57f0.233±0.05gVC54.06±0.40f43.10±0.35g0.206±0.04h

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表7抗氧化活性與總酚、總黃酮的相關(guān)系數(shù)表?

Table 7 The correlation coefficient of antioxidant activity and total phenol, total flavonoids difference

項(xiàng)目DPPHABTS還原力總酚總黃酮DPPH1.000 0 ABTS0.832 4??1.000 0 還原力0.689 7?0.823 3??1.000 0 總酚0.992 0??0.831 4??0.887 6??1.000 0 總黃酮0.797 0??0.836 9??0.724 3?0.776 5??1.000 0

? “**”表示P<0.01，差異極顯著；“*”表示P<0.05，差異顯著。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，8種乳酸菌發(fā)酵鳳丹花瓣浸提液，部分乳酸菌能夠增加其總酚、總黃酮含量，提高抗氧化能力。其中植物乳桿菌發(fā)酵后總酚和總黃酮的含量最高，與對(duì)照組相比分別提高了4.95%和12.51%(P<0.05)。蘆丁和槲皮素是鳳丹花瓣浸提液中主要的單體酚，保加利亞乳桿菌發(fā)酵后分別提高了3.16%和0.81%(P<0.05)。植物乳桿菌發(fā)酵后，DPPH自由基清除率增加了11.14%(P<0.01)，ABTS自由基清除率增加了6.58%(P<0.05)，還原力增加了16.19%(P<0.05)，其抗氧化能力是8種乳酸菌中最強(qiáng)的。植物乳桿菌發(fā)酵后，總色差△E>2，發(fā)酵液顏色較深，而保加利亞乳桿菌相對(duì)較好。因此，后期將采用植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌來發(fā)酵鳳丹花瓣。2種乳酸菌均能一定程度提高總酚、總黃酮含量，保加利亞乳桿菌對(duì)單體酚的組成和含量影響大，而植物乳桿菌發(fā)酵后抗氧化能力最強(qiáng)，故這2種乳酸菌發(fā)酵鳳丹花瓣可提升其生理功能。