◎ 鄒德生，谷 昊

（鞍山師范學(xué)院化學(xué)系，遼寧 鞍山 114005）

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一種酸性黏多糖，純品為白色或淡黃色粉末，易溶于水不溶于有機(jī)溶劑，在動物軟骨中含量豐富，具有促進(jìn)軟骨再生、預(yù)防角膜炎、抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗感染，增強(qiáng)免疫功能抗腫瘤等生物學(xué)活性，可應(yīng)用于臨床藥物與保健食品[1]。近年來，市場對硫酸軟骨素的需求不斷加大，呈現(xiàn)供不應(yīng)求的局面[2]，我國是硫酸軟骨素出口第一大國，但我國企業(yè)多采用濃堿浸提法生產(chǎn)，此方法存在得率低、純度低、污染大、成本高等問題[3]，因此探索硫酸軟骨素新的生產(chǎn)技術(shù)，減少生產(chǎn)成本和對環(huán)境的污染，提高產(chǎn)品得率和純度，具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

（1）實(shí)驗(yàn)材料。豬、羊喉管軟骨，購自學(xué)校周邊屠宰場。

（2）實(shí)驗(yàn)試劑。醋酸桿菌，實(shí)驗(yàn)室自有；堿性磷酸酶、木瓜蛋白酶，購自廈門泰金生物技術(shù)有限公司；硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品，購自SIGMA公司；其他材料均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

粉碎機(jī)FZ125（天津泰斯特儀器有限公司）、HH4數(shù)顯水浴鍋（國華儀器有限公司）、干燥箱ZB101（國華儀器有限公司）、離心機(jī)D-04B（日本東芝公司）、TU-1900紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、冷凍干燥機(jī)SCIENTZ-120（寧波新知生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 軟骨預(yù)處理

取豬、羊軟骨置于鍋內(nèi)煮沸約30 min，剔除雜質(zhì)后粉碎，過篩后備用。

2.2 硫酸軟骨素提取

取醋酸桿菌接種于200 g軟骨粉中，于發(fā)酵罐中在35 ℃下處理24 h，取出后于95 ℃水浴滅活10 min。冷卻后調(diào)節(jié)pH至10.5，加入一定濃度的堿性蛋白酶于37 ℃恒溫處理數(shù)小時。再調(diào)節(jié)pH至6.4，加入木瓜蛋白酶于37 ℃水解數(shù)小時，后于80 ℃水浴滅活10 min。在4 ℃ 12 000 r·min-1離心 5 min后在上清液中加入活性炭低溫靜置2 h，用MNWC 6000中空纖維超濾器過濾[4]。在濾液中加入無水乙醇沉淀，真空干燥后即得硫酸軟骨素純品。

2.3 硫酸軟骨素含量測定

采用間苯三酚法測定硫酸軟骨素含量[5]，取硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品配制成20 mg·mL-1的溶液，分別取0.2、0.4、0.6、0.8 mL和 1.0 mL放于 10 mL容量瓶中，加間苯三酚3 mL并加水1 mL，在廢水浴中放置30 min，去除冷卻后加冰醋酸至刻度，于558 nm波長處測定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 硫酸軟骨素純度測定

采用瓊脂糖電泳法測定硫酸軟骨素純度[6]，配制0.75%的瓊脂糖凝膠，以硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品為對照，每孔加30 μL提取液，用pH 8.6的電泳緩沖液電泳，電壓150 V，電泳時間1.5 h。電泳完畢后染色，掃描后用BandScan軟件分析純度。

3 結(jié)果與分析

由于硫酸軟骨素多糖與蛋白交聯(lián)，研究表明溫度超過60 ℃時，就會開始分解[7]，所以如長時間高溫處理會影響產(chǎn)品純度與收率，所以本實(shí)驗(yàn)采用醋酸桿菌和各種酶類的最適溫度和最適pH，對醋酸桿菌濃度，堿性蛋白酶濃度和木瓜蛋白酶濃度3個因素進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)。

3.1 硫酸軟骨素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，硫酸軟骨素濃度在0.1～1.0 mg·mL-1時，吸光度與濃度成正相關(guān)，如圖1所示，相關(guān)方程為 y=0.664 9x-0.005 4，R2=0.998 9。

圖1 硫酸軟骨素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 醋酸桿菌濃度對提取率的影響

醋酸桿菌具有強(qiáng)力分解蛋白質(zhì)的功能，可以用于分解軟骨中的蛋白質(zhì)成分。在6個小型發(fā)酵罐中分別加入200 g軟骨粉，加入不同濃度的醋酸桿菌，濃度分別為 4、5、6、7 g/100 mL和8 g/100 mL，在 35 ℃下處理24 h，結(jié)果如圖2所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，醋酸桿菌的最佳濃度為6 g/100 mL，繼續(xù)增大醋酸桿菌濃度得率沒有顯著增加。

圖2 醋酸桿菌濃度對提取率的影響圖

3.3 堿性蛋白酶濃度對提取率的影響

查閱使用手冊可知，此堿性蛋白酶的最適pH為11。取5個三角燒瓶，在發(fā)酵液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的堿性磷酸酶，在37 ℃，pH為11下酶解4 h，結(jié)果如圖3所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，堿性磷酸酶的最佳濃度為1.5%，如繼續(xù)增大酶濃度，得率不會繼續(xù)增大。

圖3 堿性蛋白酶濃度對提取率的影響圖

3.4 木瓜蛋白酶濃度對提取率的影響

查閱木瓜蛋白酶使用手冊可知，此酶最適pH為6.5。取5個三角燒瓶，在發(fā)酵液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的木瓜蛋白酶，在37 ℃，pH為6.5的條件下酶解4 h，結(jié)果如圖4所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，木瓜蛋白酶的最佳濃度為1.5%，繼續(xù)增大酶濃度，產(chǎn)率下降，這可能是由于在酶濃度過高時，酶活力無法完全發(fā)揮反而成為一個雜蛋白而降低了得率。

圖4 木瓜蛋白酶濃度對提取率的影響圖

3.5 硫酸軟骨素的純度分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，得凝膠掃描圖如圖5，電泳圖從左至右依次為標(biāo)準(zhǔn)品孔道，空白對照孔道，3次提取液樣品孔道。由圖5可知，試驗(yàn)中提取到的樣品分子質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)品一致，在樣品提取液孔道上方和下方有少量雜蛋白條帶存在，經(jīng)凝膠分析軟件BandScan軟件分析可知，樣品純度達(dá)到92.77%，已經(jīng)可以滿足出口要求。

圖5 硫酸軟骨素瓊脂糖凝膠電泳圖

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了采用醋酸桿菌輔助酶解法提取硫酸軟骨素的最佳工藝條件，結(jié)果表明在醋酸桿菌濃度6 g/100 mL，發(fā)酵溫度35 ℃；堿性蛋白酶濃度1.5%，酶解時間4 h；木瓜蛋白酶濃度1.5%，酶解時間4 h，在此條件下硫酸軟骨素提取為7.65%，純度為90.77%。由結(jié)果可知，相比于目前廣泛采用的濃堿浸提法，本法的硫酸軟骨素產(chǎn)率比濃堿浸提法稍低，但是純度遠(yuǎn)高于濃堿浸提法，而且本法具有成本低，操作簡便，對環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。