王文濤，李斯明

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見的退行 性關節(jié)疾病，中老年人好發(fā)。OA的主要病理變化包括關節(jié)軟骨的進行性丟失和破壞、軟骨下骨增厚、骨贅形成、滑膜炎癥、韌帶及半月板退行性變和關節(jié)帽肥大等[1-2]。而軟骨細胞作為軟骨組織中唯一的細胞類型，在軟骨組織穩(wěn)態(tài)的維持以及軟骨細胞外基質代謝的調節(jié)中起重要作用。軟骨受損時會分泌一系列新的蛋白來修復損傷的細胞外基質，這一過程將改變軟骨的內環(huán)境平衡，增加相關細胞因子分泌，影響凋亡通路，導致軟骨細胞凋亡，引起關節(jié)軟骨退變甚至鈣化，影響關節(jié)功能。本文圍繞近年來OA 關節(jié)軟骨細胞凋亡所涉及的炎癥反應、信號通路及靶點調控等三方面內容，綜述軟骨細胞凋亡在OA發(fā)病機制中的重要作用，總結通過抑制軟骨細胞凋亡而阻斷關節(jié)軟骨退變的機制，為OA的預防及早期治療提供理論基礎。

1 軟骨細胞凋亡與炎癥介質

既往普遍認為OA 是一種典型的非炎性關節(jié)病，后來人們發(fā)現(xiàn)OA 患者多伴有滑膜炎癥，且炎癥與OA 進展直接相關[3]，軟骨細胞中的炎癥介質，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、白細胞介素（interleukin，IL）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和基質降解酶等，可通過某些途徑（如死亡受體途徑）誘導軟骨細胞凋亡，進而引起關節(jié)軟骨的退變[4]。

1.1 ROS

ROS 能夠抑制成骨家族譜系細胞的增殖分化并導致其死亡，繼而促進破骨細胞形成和分化，影響骨質疏松的發(fā)生發(fā)展[5-6]，從這個意義上講，對于OA 等骨質疏松相關疾病，ROS 介導的氧化應激是關鍵的致病因素之一。

研究表明，OA 中軟骨細胞凋亡可由ROS 及誘導型一氧化氮合酶（induced NO synthase，iNOS）表達的炎癥介質引起；此外，ROS刺激下軟骨蛋白水解酶合成水平更高，導致軟骨細胞分解代謝過程中的平衡被打破[7]；而高水平ROS 聚集可破壞細胞膜、核酸、線粒體，并通過腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）橋接的ROS-TNF發(fā)生交聯(lián)反應，進一步引起炎癥和細胞死亡[8]。

抗氧化劑可削弱這一現(xiàn)象[5]，如過氧化氫酶，能夠有效降低人類軟骨細胞內ROS 含量，增強其對軟骨細胞的抗凋亡作用，為軟骨修復、體外活細胞擴增提供了新的研究方向[9]。

1.2 IL

IL-1 是人體炎癥感染時產生的多功能細胞因子，而OA 軟骨細胞凋亡受IL-1β水平的直接影響[10]。IL-1β可抑制細胞外基質蛋白合成，刺激細胞分解代謝蛋白酶的釋放，進而干擾軟骨細胞的代謝，介導對關節(jié)組織的破壞[11-12]；亦可通過損傷線粒體DNA、抑制轉錄等方式促進軟骨細胞凋亡[13]；此外，IL-1β可通過提高TNF-α的活性來發(fā)揮協(xié)同效應[14]。諸多臨床研究結果顯示，OA患者血漿IL-4R、IL-6濃度顯著高于健康對照組[15-16]，而這些細胞因子的水平與膝關節(jié)OA 的嚴重程度呈正相關[17-18]。

近年來OA 藥物治療的相關文獻也從側面證實IL 等促炎癥因子與OA 的相關性。白藜蘆醇被證實可通過抑制OA 大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18 等促炎癥細胞因子的表達，降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）3/9 活性，保護大鼠免受炎癥損害，阻止關節(jié)炎進程[19-20]；Hu 等[21]研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷可調節(jié)bax/bcl-2/Caspase-3 信號通路，進而抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡。

1.3 NO

作為一種慢性關節(jié)炎癥，OA 可導致NO 等炎癥介質的過度產生[22]，反之，NO 可誘導線粒體損傷和Caspase-3 活化，Caspase-3 通過激活依賴Caspase 的核酸內切酶（Caspase activated dnase，CAD），引起細胞核內染色體DNA降解及凝結，同時促使細胞骨架蛋白的解體和重組，形成凋亡小體，進而誘導軟骨細胞凋亡[23-24]。其另外一個作用途徑是與超氧化陰離子反應生成過氧化亞硝基陰離子，在酸性條件下生成強氧化性和強細胞毒性的自由基，進而造成OA 軟骨細胞和滑膜細胞的損傷[25]。

施犇等[26]探討緩激肽B2 受體（bradykinin receptor B2，BDKRB2）+9/-9bp 基因多態(tài)性與OA患者血清NO的關系，結果顯示+9/-9bp和-9/-9bp基因型OA 患者NO 水平明顯高于正常人，血清NO 水平與BDKRB2 基因多態(tài)性、KL 分級呈正相關，提示BDKRB2+9/-9 bp多態(tài)性可能是OA的遺傳調節(jié)劑，可通過影響人體血清中的NO 水平，間接影響OA的發(fā)病進程。

此外，誘導型iNOS 可通過調節(jié)NO 的生成來參與OA的發(fā)病進程，故其可作為治療OA的潛在靶標[27]。藥物、高壓氧、低水平激光和低強度脈沖超聲治療均可通過直接抑制iNOS 的表達而發(fā)揮軟骨保護功能，iNOS間接抑制劑（如IL-1抑制劑）也同樣具有一定的軟骨保護作用[28]。

1.4 基質降解酶

金屬蛋白酶（metalloproteinase，MMP）家族有多個成員，其中以MMP-3、MMP-13 與OA 軟骨細胞外基質降解最為密切，兩者均可通過降解細胞外基質中的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，加劇軟骨細胞凋亡，促使關節(jié)軟骨的降解和破壞。檢測關節(jié)液中MMP-2、MMP-3、MMP-9 和基質金屬蛋白酶抑制 因 子（matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP）-1 水平對OA 的早期診斷、病情判斷、預后評價有一定的意義[29]。李保馳[30]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3、MMP-13蛋白在OA組滑膜中表達量明顯高于非OA 組，且兩者的表達水平呈正相關性，因此推測MMP-3、MMP-13 可能作為診斷OA 的一項重要指標。亦有學者指出，OA 患者病程越長、癥狀越重，滑膜中MMP-3、MMP-13和前炎癥細胞因子IL-17 含量就越多，兩者之間存在相關性；而在OA 的病理過程中，IL-17 能上調MMP-3、MMP-13的表達，致使MMP/TIMP比例失衡，進而引起關節(jié)軟骨基質的退變[31]。

2 軟骨細胞凋亡與信號通路

2.1 內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應通路

機體在接受某些理化因素刺激后，內質網中產生相當數(shù)量的折疊錯誤蛋白，出現(xiàn)未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），相關信號通路得以激活，誘發(fā)ERS 反應途徑并促進細胞凋亡。正常機體在應激狀態(tài)下其內質網蛋白降解相關系統(tǒng)能調節(jié)折疊錯誤蛋白和未折疊蛋白，使其形成正確的折疊，繼續(xù)維持軟骨細胞活性；而當這種穩(wěn)態(tài)失去平衡、ERS狀態(tài)持續(xù)存在時，機體將激活細胞凋亡以清除這些受損的軟骨細胞，引起關節(jié)軟骨的進行性退化[32]。

有學者對正?；颊呒霸缙?、晚期OA患者的軟骨細胞進行檢測，結果表明內質網功能標記物——B 細胞淋巴瘤/白血?。˙-cell lymphoma/leukemia，Bcl）-2結合拮抗凋亡基因1（Bcl-2 associated athanogene 1，bag-1）和葡萄糖調節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，grp78）在晚期OA軟骨細胞中的表達均上調[33]，提示ERS 系統(tǒng)充分參與了OA 軟骨細胞凋亡的過程。ERS 還可與晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）構成分子復合體，在OA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[34]。Takada 等[35]的研究亦表明，ERS 相關蛋白CHOP、Ub、pPERK 及pJNK 等與OA軟骨細胞變性及凋亡均呈正相關，進一步證實了有關ERS 反應通路參與OA 軟骨細胞凋亡、伴隨OA進展的推測。

2.2 線粒體通路

OA 軟骨細胞的線粒體常有一定程度的功能紊亂，加劇了軟骨細胞的基質分化、凋亡及鈣化，線粒體DNA的修整能力也同時下降，上述變化是促成OA 軟骨細胞凋亡的關鍵因素之一[36]。在接受凋亡信號刺激后，軟骨細胞內線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，膜外電位變低，外膜破裂，細胞色素C（cytochrome C，cytC）、線粒體促凋亡蛋白Smac、凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等釋放入細胞質，觸發(fā)Caspase 級聯(lián)反應，導致軟骨細胞凋亡[37]。

已有實驗證實，軟骨細胞Ca2+持續(xù)增加可激活線粒體膜間隙鈣蛋白酶，此酶可切斷膜結合的AIF，可溶性的AIF 片段通過Bax/Bak 介導的小孔釋放到線粒體外，或經MPTP 釋放，最終導致軟骨細胞凋亡[38]；Shen等[39]指出，線粒體途徑相關的IL-1β在血清剝奪下具有顯著的促凋亡作用。

有學者從威靈仙提取出富含皂苷的有效成分，結果表明，該成分能阻止線粒體膜電位去極化，抑制Caspase-3 活化，進而阻斷軟骨細胞的凋亡進程，保護軟骨細胞[40]。

2.3 死亡受體通路

OA軟骨細胞的病理變化歸因于細胞凋亡[41]。而死亡受體是一組細胞表面標志物，與相對應的配體結合后可傳遞凋亡相關信號，進而參與OA軟骨細胞的凋亡過程。

死亡受體通路最經典的是TNF和TNFR信號通路。TNFR 包括TNFR-1 和TNFR-2 兩種受體。TNFR-1分布于體內大多數(shù)細胞（包括骨關節(jié)軟骨細胞），內部有同源的氨基酸序列，即死亡結構域。當TNFR-1 的死亡結構域和TNF 受體相關死亡結構域（TNF receptor-associated death domain，TRADD）結合蛋白相結合時，就會啟動OA軟骨細胞的凋亡。 其與Fas 相關死亡結構域（Fas-associated death domain，F(xiàn)ADD）蛋白結合，募集 與 活 化Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8，而FADD與Caspase-8前體形成死亡誘導信號復合物（death-inducing signaling complex，DISC），可催化Caspase-8 前體并激活Caspase-8；隨后，Caspase-8又激活下游的Caspase-3 及其他效應Caspase，引起細胞凋亡[42]。近期高遠[43]的研究還發(fā)現(xiàn)，TNFR信號通路能夠在氧氟沙星和麻保沙星的誘導下被激活，增加相關下游信號因子的表達水平，促進幼齡犬軟骨細胞的凋亡。

2.4 應激活化蛋白激酶信號通路

應激活化蛋白激酶又名c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），正常情況下多存在于胞質內，受到刺激后快速堆積至核內，引起相關基因表達的變化。人絲裂原激活蛋白激酶1（human mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）即可通過自身磷酸化，誘導激活JNK 信號通路，促進OA細胞凋亡[44]。

而作為與JNK 信號通路密切相關的生物分子，凋亡調節(jié)蛋白Bim亦與OA軟骨細胞凋亡密切相關。Ye 等[45]采用IL-1β誘導鼠OA 軟骨細胞，激活JNK-c-Jun 信號通路，c-Jun 蛋白與Bim 表達上升；通過RNA干擾技術干擾JNK-c-Jun通路后，再用IL-1β誘導鼠OA軟骨細胞時Bim含量未見明顯上調，證實JNK-c-Jun信號通路可直接上調Bim分子的表達水平，進而調控細胞凋亡。Ismail等[46]的研究還證實，JNK-2信號通路被IL-1β激活后，可誘導脂蛋白受體相關蛋白1（lipoprotein receptorrelated protein 1，LRP-1）從細胞膜上脫落，軟骨細胞分泌的蛋白聚糖酶連續(xù)被LRP-1 內吞，導致軟骨細胞基質分解增多，加速軟骨細胞凋亡。而使用JNK 抑制劑CE11004 或SP600125 抑制JNK/c-Jun 通路后，凋亡調節(jié)因子p53 重組蛋白（P53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）表達量明顯減少，凋亡進程放緩，推測PUMA蛋白可能參與了JNK信號通路介導的軟骨細胞凋亡過程[47]?？傊?，JNK 通路與OA 軟骨細胞損傷、凋亡及誘導產生基質MMP 等密切相關，其異常激活可加速OA的進展。

3 軟骨細胞凋亡與靶點調控

OA 軟骨細胞凋亡受基因、蛋白質、微小RNA的影響，通過靶向調節(jié)這些細胞凋亡通路中的關鍵分子，可以實現(xiàn)對軟骨細胞內環(huán)境平衡、線粒體膜通透性、內質網穩(wěn)態(tài)等的調控，最終達到抑制軟骨細胞凋亡的目的[48]。

3.1 基因靶點

3.1.1 SOX-9 作為一種高遷移率群結構域轉錄因子，SOX-9在軟骨細胞和其他組織中均有表達，被認為是軟骨細胞譜系調節(jié)器，能夠增強軟骨聚集蛋白多糖基因中啟動子的活性，在軟骨發(fā)生中起到關鍵作用[49]。Beckmann等[50]研究發(fā)現(xiàn)，OA軟骨中SOX-9 表達增高后，軟骨細胞存活數(shù)量相應增加，而SOX-9 表達減少則對人OA 軟骨細胞凋亡產生重要影響。此外，在軟骨間質前體中SOX-9是成骨細胞特異性基因強轉錄激活因子RUNX-2的主要調節(jié)因子，Orfanidou 等[51]研究發(fā)現(xiàn)，OA 患者軟骨細胞中SOX-9 表達減少，RUNX-2 和MMP-13 表達增加，提示SOX-9 對軟骨細胞有保護作用，RUNX-2和MMP-13對軟骨有促降解和促凋亡作用。

3.1.2 Bcl-2 與BAX Bcl-2 定位于第18 號染色體，其家族基因可作用于線粒體，在凋亡中發(fā)揮相應功能。Li 等[52]的研究結果表明，Bcl-2 在膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）滑膜中高表達，其水平與KOA 嚴重程度呈正相關，檢測KOA 患者Bcl-2水平有助于對KOA病情的正確判斷。

Bcl-2家族含有一種特定的同源結構域，家族成員能借此構成同源二聚體，BAX 是其中的一員。當Bcl-2 超量組成Bcl-2 二聚體時，軟骨細胞偏向于存活；而當BAX 超量構成BAX 二聚體時，軟骨細胞則偏向于凋亡；Bcl-2與BAX之間也可構成二聚體，當Bcl-2/BAX比值升高時，抑制細胞凋亡，反之則促進凋亡[53]。馬春輝等[54]認為，BAX表達上調是原發(fā)性OA發(fā)病的重要因素，而在繼發(fā)性OA 中BAX 增加相對較少，這可能與軟骨細胞中多種膠原及蛋白對表型的維持有關。

3.1.3 P53 相較于正常軟骨細胞，OA 中P53 以及P53 調控相關的凋亡誘導蛋白（P53 apoptosis inducing protein，P53AIP）-1 表達水平上調更為明顯，其與軟骨細胞的凋亡直接關聯(lián)[55]。Yan等[56]發(fā)現(xiàn)，通過miR-34模擬轉染抑制沉默信息調節(jié)因子2 相 關 酶1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1，siRT1）表達，可抑制P53 的脫乙?；?，導致BAX 表達量上升和Bcl-2 表達水平降低，從而促進凋亡；而關節(jié)內注射抗miR-34 序列慢病毒載體可有效改善OA的進展，這為OA的治療選擇提供了一個新的方向。

3.2 蛋白質靶點

3.2.1 Caspase蛋白質 目前發(fā)現(xiàn)的Caspase家族至少有14種，與真核細胞的凋亡密切相關，其所引發(fā)的級聯(lián)反應是細胞凋亡過程的關鍵環(huán)節(jié)，可激活包括死亡受體和線粒體依賴途徑介導的信號轉導途徑，被激活后的下游Caspase通過切割特異性底物導致細胞凋亡。其中Caspase-3與OA軟骨細胞凋亡的聯(lián)系最為緊密[57]。陳喜德等[58]探討OA 大鼠關節(jié)軟骨細胞凋亡與Caspase-3表達的關系，結果顯示，隨著OA程度的加重，Caspase-3表達水平逐漸增加，且Caspase-3 mRNA的相對表達量與軟骨細胞凋亡的程度基本一致。

研發(fā)者們目前開始關注Caspase 抑制劑（OA藥物）的開發(fā)[59]?，F(xiàn)有研究亦表明，針刀、圓利針和電針等物理治療可借由下調BAX、Caspase-3表達來抑制兔股直肌細胞凋亡，對OA產生積極的治療效果；而不同類型的物理治療，如針灸治療、電療、運動療法，其作用機制可能存在一定差異[60]。

3.2.2 Fas/FasL Fas 及其配體FasL 是細胞凋亡的膜表面分子，作為死亡受體家族成員，F(xiàn)as/FasL 與其他死亡受體可直接關聯(lián)并影響OA 軟骨細胞的凋亡[61]。

臨床和藥理學方面，OA 患者血清中FasL 蛋白表達含量越高，則病情越輕，這也從一個側面提示FasL在抑制軟骨細胞凋亡過程中可能扮演重要角色[62]。武中慶等[63]發(fā)現(xiàn)中藥“右歸飲”可通過上調Fas、FasL 的表達水平，達到抑制膝軟骨細胞凋亡的目的；涂意輝等[61]證實地塞米松可誘導Fas/FasL 的凋亡，進而上調凋亡基因表達。以上研究均為OA軟骨細胞凋亡的深入研究提供了思路。

3.3 miRNA靶點

3.3.1 miRNA-9 miRNA 是一種長度為21～25 個核苷酸的小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，OA 患者軟骨組織中miRNA-9 表達水平明顯下降，MMP-13 表達水平明顯上升，二者之間存在互補結合位點，MMP-13 作為miRNA-9 的靶基因，受到其靶向調控，也就是說，miRNA-9可能通過抑制MMP-13的表達水平、降低其對Ⅱ型膠原蛋白的抑制作用來對抗OA[64]。而在關節(jié)腔內注射miRNA-9 激動劑后，OA大鼠軟骨組織中MMP-13表達水平受到抑制，其對Ⅱ型膠原α1鏈的拮抗作用減弱，膠原降解減少，OA的發(fā)展進程受阻[65]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和轉錄因子RUNX-2 等OA 相關基因的表達也受miRNA-9 表達水平的調控，其調控機制有待進一步的深入研究[64]?？傊?，人們可通過對miRNA-9的靶向激活調控，下調MMP-13 等的表達水平，減少OA 軟骨外基質的降解，延緩OA 的疾病發(fā)展進程。

3.3.2 miRNA-25 miRNA-25 屬于miR-106b-25簇，定位于7 號染色體的微染色體維持蛋白7（microchromosome maintenance protein，MCM7）基因的內含子上。miRNA-25 在OA 中起到抑制軟骨細胞凋亡的作用，其過度表達可阻止OA軟骨細胞凋亡并促進其增殖，抑制蛋白多糖、膠原蛋白降解，這可能為OA治療提供了新的策略[66]。

3.3.3 miRNA-30 研究證實miRNA-30可抑制基質降解酶ADAMTS-5的表達，OA患者中miRNA-30表達水平下調而ADAMTS-5 表達上調，促進軟骨細胞外基質降解，加速OA 患者軟骨細胞凋亡[67]。此外，也有實驗證實IL-1/AP-1/miRNA-30a/ADAMTS-5 通路參與了IL-1β誘導的人OA 軟骨細胞軟骨基質的降解過程[68]?？傊?，miRNA-30與ADAMTS-5 可作為軟骨穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)因子，是OA的潛在診斷和治療靶點。

3.3.4 miRNA-34a 人們發(fā)現(xiàn)在OA 軟骨組織中，miRNA-34a的表達與IL-1β表達上調呈正相關，而在IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡模型中，過表達的miRNA-34a會導致Sirt1及Bcl-2表達降低，從而促進軟骨細胞凋亡[69]，因此沉默miRNA-34a 可能成為治療OA的新方法。

4 總結與展望

在OA 的發(fā)生發(fā)展進程中，ROS、IL、NO、MMP等炎癥介質與軟骨細胞凋亡關系密切；與此同時，軟骨細胞凋亡存在ERS 反應通路、線粒體通路、死亡受體通路、JNK 信號通路等，這些信號通路與軟骨細胞的凋亡過程直接相關，對這一過程中的基因靶點、蛋白質靶點或miRNA靶點進行調控，將有助于延緩OA 進程。目前有關各個信號通路的分子調節(jié)機制及各因子的相互聯(lián)系尚未完全闡明，未來可基于以上研究研發(fā)具有針對性的靶點藥物，為OA 的早期預防及治療提供新思路。