張立營 趙權(quán)

變態(tài)反應(yīng)也稱為過敏反應(yīng)，這意味著免疫系統(tǒng)對某些對身體無害的物質(zhì)(如花粉，動物皮膚等)過于敏感，并且會發(fā)生免疫反應(yīng)，對身體造成傷害。人們每天遇到的皮膚過敏，皮膚瘙癢，發(fā)紅和腫脹都是過敏反應(yīng)。Ⅰtypeallergy又稱速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，在臨床上最常見。全世界有30%～40%的人被過敏問題困擾，過敏已成為全球第六大疾病[1-2]。日常生活中常見的過敏反應(yīng)主要是以IgE抗體(specific IgE antibodies，sIgE)介導(dǎo)、組胺等介質(zhì)釋放為基礎(chǔ)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)而產(chǎn)生。通過檢測患者血清過敏原的特異性IgE抗體，可明確患者的過敏原，對于疾病的預(yù)防、診斷及治療均具重要意義。本文按照反應(yīng)原理闡述了目前過敏原特異性IgE抗體的體外檢測常見技術(shù)，并對其研究進(jìn)展進(jìn)行了分析。

1 酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)

1971年，瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann報(bào)道了ELISA，ELISA是一種免疫標(biāo)記技術(shù)，其中已知的抗原或抗體吸附在固相載體的表面上，以使酶標(biāo)記的抗原-抗體在固體表面上反應(yīng)[3]。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體，具有快速、靈敏、簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化載體的優(yōu)點(diǎn)。檢測IgE抗體時，普通酶免法是將過敏原包被在固相載體上，然后加入患者血清，此時患者血清中除了特異性IgE抗體外，特異性IgG抗體也會和過敏原結(jié)合，造成載體上部分位點(diǎn)的搶占。而捕獲法是將抗人IgE抗體包被在固相載體上，加入患者血清后，血清中的IgE抗體都被結(jié)合，而IgG抗體不會被結(jié)合下來而被洗脫，隨后加入待檢過敏原，再加入酶和底物顯色。由于該法去除了血清中IgG抗體的干擾，從而明顯提高了IgE抗體檢測的靈敏度。使用捕獲法可以完全捕獲出血清中的IgE抗體，去除IgG抗體干擾，顯著提高檢測IgE水平的敏感度，并且可以實(shí)現(xiàn)過敏原自由靈活組合、定量檢測[4-5]。

2 放射過敏原吸附試驗(yàn)(radio allergosorbent test，RAST)方法

RAST將純化的過敏原與固相載體相結(jié)合，添加待測血清和參照對照，然后與同位素標(biāo)記的抗IgE抗體反應(yīng)，然后測定固相的放射活性，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定待測血清中特異性IgE的含量，或者當(dāng)樣品的放射性高于正常人數(shù)加3S時判斷為陽性。這種試驗(yàn)方法的發(fā)展首次使得對過敏原特異性IgE進(jìn)行可靠的識別，至此，過敏原特異性IgE水平的體外測定及過敏癥臨床病史開始成為過敏癥研究及臨床診斷方面的根基。RAST的原理是在固體載體上使過敏原與相關(guān)特異人群血清的IgE結(jié)合，通過競爭性結(jié)合IgE，利用同位素或酶標(biāo)記抗體，配合熒光底物檢測結(jié)合IgE的抗體[6-7]。RAST方法雖然簡便、快速、靈敏，但由于應(yīng)用到放射性標(biāo)記物質(zhì)，存在一定的放射性污染風(fēng)險(xiǎn)。

3 免疫印跡法(Western blot，WB)

WB是一種將高分辨率凝膠電泳與免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)?；驹硎峭ㄟ^特異性抗體對凝膠電泳處理的細(xì)胞素膜)，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分[8-10]。

4 化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)

CLIA將高靈敏度化學(xué)發(fā)光測量技術(shù)與高度特異性免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測和分析各種抗原，半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物。它是放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析后開發(fā)的一種新的免疫分析方法。從臨床實(shí)踐看，當(dāng)血液樣本中的IgE濃度很低時，傳統(tǒng)檢測技術(shù)由于受到檢測靈敏度、特異度和檢測范圍等因素的限制可能出現(xiàn)檢測結(jié)果陰陽性不符的情況。納米磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫診斷技術(shù)綜合采用了目前國際上的兩大主流免疫分析尖端技術(shù)——懸浮磁微粒載體技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，該系統(tǒng)具有檢測范圍寬、靈敏度高、特異度強(qiáng)、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)和特性，從方法學(xué)角度來看其優(yōu)于熒光酶免法[11-14]。其優(yōu)勢在于過敏原可以隨機(jī)、自由組合，敏感度高、特異度強(qiáng)，全定量。

5 微流控芯片技術(shù)(microfluidics)

微流控芯片技術(shù)將生物、化學(xué)和醫(yī)學(xué)分析過程中的樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測等基本操作單元集成到微米級芯片上，自動完成整個分析過程[15-18]。目前有該技術(shù)用于過敏原IgE抗體檢測，此微流體免疫技術(shù)系統(tǒng)將自動化微流體技術(shù)、蛋白質(zhì)微數(shù)組技術(shù)、冷光分析技術(shù)與平行化IgE分析技術(shù)相結(jié)合。將過敏原固定于微流卡反應(yīng)區(qū)，可同時平行處理數(shù)十種過敏原特異性IgE抗體，藉由微流體的導(dǎo)入，血清用量僅需100微升；隨后通過加入試劑進(jìn)行相應(yīng)反應(yīng)并置于化學(xué)發(fā)光分析儀上進(jìn)行判讀結(jié)果，全程約35 min完成[19-20]。此技術(shù)優(yōu)勢在于靈敏度高、快速、樣本量需求少，但目前還缺少大通量自動化儀器。

6 總結(jié)

研發(fā)過敏原體外診斷檢測技術(shù)是過敏性疾病預(yù)防、診斷和治療的核心之一。近年來，過敏性疾病基于IgE抗體檢測而診斷變態(tài)反應(yīng)性疾病的研究發(fā)展迅速，形成了諸多檢測手段。在分級診療的大背景下，不同級別醫(yī)院對于過敏原特異性IgE抗體體外檢測的性能需求不同?；鶎俞t(yī)院以滿足過敏患者首診需求、降低費(fèi)用為主，會以定性/半定量篩查或靈活組合為主，三級醫(yī)院為保證檢驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性，會更需要全定量檢測產(chǎn)品。目前在國內(nèi)全定量檢測產(chǎn)品仍較少，且成本高昂，不利于全面開展變態(tài)反應(yīng)臨床工作。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展以及過敏性疾病診治研究進(jìn)展的深入，過敏原檢測的定性或半定量技術(shù)將逐漸向定量轉(zhuǎn)變。過敏原體外診斷檢測技術(shù)有著光明的發(fā)展前景。