■隋美霞 海 風(fēng) 王宗偉 王漢海

(1.濰坊學(xué)院山東省生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊261061；2.沈陽鳥島管理有限公司，遼寧沈陽110000；3.山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局，山東壽光262700）

Zn元素因具有廣泛的生理生化功能而被稱為機(jī)體的“生命元素”，同時(shí)也是必需的微量元素之一。然而，不同狀態(tài)鋅源鋅在機(jī)體內(nèi)的生物利用率有顯著差異。目前，生物制品中的Zn大多停留在應(yīng)用原子吸收光譜進(jìn)行鋅的含量研究[1]，并未涉及到其結(jié)構(gòu)，X射線吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)（X-ray absorption fine structure，XAFS）技術(shù)不只是局限于結(jié)晶物質(zhì)結(jié)構(gòu)和物質(zhì)電子結(jié)構(gòu)的研究，還可研究吸收原子的幾何結(jié)構(gòu)和化合態(tài)。此外，XAFS技術(shù)能檢測(cè)出與該微量元素相臨界元素的氧化狀態(tài)。目前，對(duì)Zn元素的研究主要集于飼養(yǎng)試驗(yàn)，大多數(shù)是對(duì)日糧中添加不同狀態(tài)鋅源的效果進(jìn)行了報(bào)道，但對(duì)其在反芻動(dòng)物十二指腸內(nèi)的吸收特點(diǎn)及消化機(jī)理研究甚少，主要原因是缺乏有效的測(cè)定方法。本試驗(yàn)?zāi)康氖菓?yīng)用XAFS探討外翻腸囊試驗(yàn)條件下，不同狀態(tài)的鋅源鋅經(jīng)綿羊十二指腸腸囊吸收后濃度及狀態(tài)變化。探索XAFS技術(shù)在動(dòng)物營養(yǎng)研究中Zn的應(yīng)用，并為反芻動(dòng)物不同狀態(tài)鋅源的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

不同狀態(tài)鋅源鋅標(biāo)準(zhǔn)品:氧化鋅，ZnO含量≥95.00%，Zn含量76.75%；硫酸鋅，ZnSO4含量≥97.00%，Zn含量35.55%；蛋氨酸鋅，ZnMet含量≥81.50%，Zn含量18.97%；賴氨酸鋅，ZnLys含量≥28.00%，Zn含量5.31%。

在上海光源XAFS試驗(yàn)站進(jìn)行Zn元素的XAFS譜測(cè)定，其中，電子能量為800 MeV，平均電流強(qiáng)度為105.6 mA。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取體格健壯、體重相近的18頭綿羊作為十二指腸的供體動(dòng)物，禁食12 h，屠宰，立即分離出10 cm長的十二指腸中段，用39～40℃的生理鹽水沖洗，參照Seal等[2]所述方法，制成外翻腸囊，立即投入盛有20 ml按試驗(yàn)處理安排配制的不同形態(tài)鋅培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，向瓶?jī)?nèi)充入95%O2和5%CO2后，密閉條件下40℃水浴振蕩培養(yǎng)(100 r/min)40 min[3]，整個(gè)過程不應(yīng)超過15 min（保證腸段具有正常的生理機(jī)能）。按等量鋅在上述處理中加入6種不同鋅源（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys）。培養(yǎng)結(jié)束后，腸段用生理鹽水反復(fù)沖洗，65℃干燥24 h，待用。同步輻射裝置上測(cè)定Zn的XAFS譜，同時(shí)測(cè)定鋅源標(biāo)準(zhǔn)品（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys）的XAFS譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用 origin（6.1）軟件整理后，同時(shí)進(jìn)行歸一化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鋅源標(biāo)準(zhǔn)品的XAFS譜

飼料級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品鋅源的K邊XAFS譜見圖1。

在XAFS圖譜中，Zn的K邊吸收值為9 659 eV，總能量范圍在100 eV內(nèi)。通過圖譜可以看出，四種鋅源標(biāo)準(zhǔn)品的XAFS譜吸收值差距明顯，兩種無機(jī)鋅較兩種有機(jī)鋅的K邊吸收值顯著增大。ZnO與另外三種鋅源不同點(diǎn)主要表現(xiàn)為，其在主吸收峰的低結(jié)合能一側(cè)有肩峰，表明樣品中飼料級(jí)ZnO中的Zn可能存在兩種或兩種以上的不同化學(xué)狀態(tài)，但其主化學(xué)狀態(tài)為ZnO；此外，局域結(jié)構(gòu)也有所不同，這可能是鋅周圍氧原子數(shù)目不同導(dǎo)致形成的。其它三種鋅源譜線表明基本只有一種化學(xué)狀態(tài)。由以上譜線顯示的能量和局域結(jié)構(gòu)可以看出，Zn在這四種標(biāo)準(zhǔn)品中的結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

圖1 四種標(biāo)準(zhǔn)品鋅的K邊XAFS譜線

2.2 十二指腸腸囊中不同鋅源的濃度和結(jié)構(gòu)變化

十二指腸腸囊中四種鋅源（ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys）的K邊XAFS譜線見圖2。

圖2 十二指腸腸囊中不同鋅源的K邊XAFS譜線

由圖2可以看出，經(jīng)過密閉震蕩培養(yǎng)40 min后，ZnO、ZnSO4、ZnMet、ZnLys四種鋅源的譜線基本相同，但有機(jī)鋅組（ZnMet、ZnLys）相對(duì)濃度明顯優(yōu)于無機(jī)鋅組（ZnO、ZnSO4），ZnMet突變最大，ZnO突變最小，即十二指腸壁中ZnMet組鋅濃度最高，ZnO組鋅濃度最低，這說明在十二指腸體外培養(yǎng)過程中有機(jī)鋅較易吸收。此外，從該圖中也可以看出有機(jī)鋅較無機(jī)鋅K邊吸收值較小，但四種鋅源吸收峰后的曲線形狀非常相似，說明經(jīng)過體外培養(yǎng)十二指腸壁中Zn的化學(xué)狀態(tài)相同。

十二指腸腸囊中不同鋅源（ZnSO4、ZnMet、ZnLys、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys）的K邊XAFS譜線見圖3。

圖3 十二指腸腸囊中不同鋅源的K邊XAFS譜線

由圖3可以看出，經(jīng)過密閉震蕩培養(yǎng)40 min后，這5種鋅源的譜線基本相同，吸收峰后的曲線形狀非常相似，說明經(jīng)過體外培養(yǎng)十二指腸腸囊中Zn的化學(xué)狀態(tài)相同，但是其相對(duì)濃度卻發(fā)生了明顯變化，順序 依 次 為 ZnSO4+Met＜ZnSO4+Lys＜ZnSO4＜ZnLys＜ZnMet。

ZnSO4、ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys三種鋅源來說，ZnSO4的突變最大，其相對(duì)濃度相對(duì)最高，而ZnSO4+Met、ZnSO4+Lys這兩組差別不大，說明雖然在ZnSO4中添加了蛋氨酸和賴氨酸，但在吸收過程中，這兩種游離氨基酸并未促進(jìn)鋅元素的吸收，反而抑制其吸收。

對(duì)于 ZnSO4、ZnMet、ZnSO4+Met三種鋅源來說，ZnMet的突變最大，其相對(duì)濃度相對(duì)最高，其次是Zn-SO4，最后是ZnSO4+Met，說明有機(jī)鋅較易被吸收，添加蛋氨酸抑制鋅元素的吸收，但是其結(jié)構(gòu)均相同。Zn-SO4、ZnLys、ZnSO4+Lys三種鋅源的吸收情況與ZnSO4、ZnMet、ZnSO4+Met的相似。

3 討論

3.1 XAFS技術(shù)測(cè)定元素的優(yōu)越性

同步輻射XAFS技術(shù)除了能夠定性定量檢測(cè)大多數(shù)的微量元素，且能研究吸收原子的幾何結(jié)構(gòu)和化合態(tài)，鑒于此，XAFS技術(shù)將是生命科學(xué)研究的重要手段[4]。但目前XAFS技術(shù)在生物樣品中的應(yīng)用較少，僅有少量研究報(bào)道了應(yīng)用Synchrotron radiation評(píng)定飼料中的微量元素[5]，但試驗(yàn)結(jié)果顯示，XAFS譜峰值對(duì)不同元素的價(jià)態(tài)均極為敏感，不同價(jià)態(tài)微量元素的XAFS譜可以很好被分開。

3.2 外翻腸囊技術(shù)在動(dòng)物試驗(yàn)中的優(yōu)越性

外翻腸囊技術(shù)即從屠宰的動(dòng)物活體立即取出小腸后分割，將各片段外翻結(jié)扎，向囊狀物中注入特定的培養(yǎng)液（不含待測(cè)物質(zhì)），立即將其放入特定的含有待檢測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)液中，通過檢測(cè)腸囊中待檢測(cè)物質(zhì)的含量及狀態(tài)變化，從而明確元素吸收情況[6]。Evans[7]采用該方法研究了大鼠整段小腸Zn元素的最佳吸收部位，認(rèn)為外翻腸囊法是目前有效的研究微量元素吸收的方法。

3.3 十二指腸腸囊Zn的相對(duì)濃度和狀態(tài)變化

該試驗(yàn)結(jié)果可看出，在外翻腸囊試驗(yàn)條件下，十二指腸中有機(jī)鋅較無機(jī)鋅更容易被吸收。Ashmead等[8]的研究結(jié)果顯示，大鼠分離不同腸段對(duì)有機(jī)銅的吸收率是無機(jī)銅的4倍，這與本試驗(yàn)所得結(jié)果一致。但是Hill等[9]利用大鼠十二指腸外翻腸囊技術(shù)結(jié)果顯示，三種鋅源（氯化鋅、蛋氨酸鋅、賴氨酸鋅）中Zn元素在培養(yǎng)后液體中的出現(xiàn)率并無顯著差異，表明有機(jī)鋅和無機(jī)鋅的生物學(xué)活性相似。這與本試驗(yàn)結(jié)果有較大差異，出現(xiàn)上述結(jié)果不一致的原因可能與試驗(yàn)方法、所用試驗(yàn)動(dòng)物的種類、所處的生理狀態(tài)不同有關(guān)。

本試驗(yàn)在無機(jī)鋅中添加游離氨基酸，非但沒有促進(jìn)鋅元素的吸收，反而抑制其吸收。計(jì)峰[10]通過外翻腸囊方法研究結(jié)果表明，無機(jī)錳與兩種氨基酸（甘氨酸、蛋氨酸）混合物的吸收率都比單一無機(jī)錳的吸收率要小，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Wapnir等[11]研究結(jié)果表明，較小分子量配體從某種程度上可以絡(luò)合Zn，從而達(dá)到防止Zn元素在生理pH值條件下生成沉淀的效果，因而可促進(jìn)Zn元素的吸收，且當(dāng)配體與鋅的比例小于或等于3∶1時(shí)作用最有效，此結(jié)論被過量組氨酸可競(jìng)爭(zhēng)性抑制組氨酸鋅的吸收所證實(shí)。Bonewitz[12]認(rèn)為，小分子量配體的作用是使飼糧中的鋅更易吸收，而不是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體系中不可缺少的組成成分。本試驗(yàn)中添加蛋氨酸及賴氨酸，可能是由于添加過量，過量的蛋氨酸及賴氨酸競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了鋅元素的吸收，所以鋅的吸收相對(duì)減少。

國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果顯示，大鼠腸道對(duì)Zn元素的吸收包含兩個(gè)基本過程，即飽和載體調(diào)節(jié)及非飽和擴(kuò)散[13-16]。Hempe等[17]認(rèn)為，這種現(xiàn)象表明Zn元素在機(jī)體腸道內(nèi)的吸收可分為跨細(xì)胞吸收和細(xì)胞間擴(kuò)散兩大類。本試驗(yàn)通過外翻腸囊技術(shù)研究綿羊十二指腸對(duì)不同狀態(tài)Zn的吸收，其中四種標(biāo)準(zhǔn)品中Zn的狀態(tài)不相同，所處環(huán)境亦不同，但經(jīng)過綿羊十二指腸吸收后，四種結(jié)構(gòu)狀態(tài)反而相差不大，極為相似，這說明有機(jī)鋅的吸收途徑可能與無機(jī)鋅的相似，即從吸收機(jī)理而言，有機(jī)鋅與無機(jī)鋅一樣，即通過不依賴于載體調(diào)節(jié)的非飽和擴(kuò)散形式被機(jī)體吸收的，有機(jī)鋅首先解離成離子，然后通過無機(jī)鋅的吸收途徑被機(jī)體腸道所吸收。于昱[18]通過試驗(yàn)結(jié)果提出了有機(jī)鋅與無機(jī)鋅的吸收途徑相似的假設(shè)，本試驗(yàn)結(jié)果確定了于昱提出的有機(jī)鋅的吸收假說，本試驗(yàn)采用XAFS技術(shù)檢測(cè)十二指腸腸囊鋅元素的吸收狀態(tài)，較于昱方法更為成熟，樣品處理更簡(jiǎn)便，而且試驗(yàn)誤差很小。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用先進(jìn)的XAFS技術(shù)，樣品制備過程簡(jiǎn)易，測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確，但影響因素相對(duì)較少。此外，通過外翻腸囊技術(shù)研究機(jī)體腸段對(duì)不同狀態(tài)Zn的吸收，試驗(yàn)結(jié)果顯示有機(jī)鋅優(yōu)于無機(jī)鋅，有機(jī)鋅更易被吸收，確定十二指腸腸道中有機(jī)鋅的吸收機(jī)理與無機(jī)鋅的相同。此外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，無機(jī)鋅與配體蛋氨酸及賴氨酸的結(jié)合反而抑制了鋅元素的吸收，這可能與無機(jī)鋅與配體比例有關(guān)，有必要開展進(jìn)一步研究。但本試驗(yàn)是在外翻腸囊的試驗(yàn)條件下測(cè)定的，有必要進(jìn)一步開展體內(nèi)試驗(yàn)加以驗(yàn)證，在既不影響動(dòng)物營養(yǎng)需要，又能提高鋅的吸收及利用率的前提下，應(yīng)用適宜廉價(jià)的鋅添加劑，從而降低飼養(yǎng)成本。