陳浩林 徐景峨 蒲齡 余波 王璇 楊莉 朱冠群* 毛鳳顯

（1，貴州省畜牧獸醫(yī)研究所 550005；2，貴州省畜禽遺傳資源管理站 550001）

綿羊細菌性腹瀉病是一種以腹瀉為特征性癥狀的消化道疾病。國內(nèi)相關(guān)試驗研究表明，綿羊細菌性腹瀉病的病因較復(fù)雜[1]，產(chǎn)氣莢膜梭菌 （CP）、大腸桿菌 （E.coli）、沙門氏菌（SE）、多殺性巴氏桿菌 (Pm)等均可引起，常為混合感染。

產(chǎn)氣莢膜梭菌在自然界分布極廣，是一種條件性致病菌，可造成人食物中毒，引起各種動物腸毒血癥、壞死性腸炎及創(chuàng)傷性氣性壞疽等疾病[2]。產(chǎn)腸毒性大腸桿菌是一種嗜熱、嗜酸、需氧菌，能引起腸黏膜細胞水與電解質(zhì)的代謝紊亂，是導(dǎo)致羔羊腹瀉的主要病因之一[3]。腸炎沙門氏菌是引起胃腸炎和食物中毒的主要病原菌之一[4]，隨著由SE引起病例的上升，不僅嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，還威脅人畜健康，已成為公共衛(wèi)生所關(guān)注的問題。羊多殺性巴氏桿菌病又稱羊出血性敗血病，由多殺性巴氏桿菌引起的急性傳染病。臨床主要表現(xiàn)為高熱、肺炎、急性胃腸炎及內(nèi)臟器官廣泛出血為特征[5]。

綿羊細菌性腹瀉主要的檢測方法有細菌的分離鑒定、血清學(xué)鑒定、PCR等方法，然而常規(guī)的診斷方法很難將此癥狀相似的疾病加以區(qū)別，而且常規(guī)的病原學(xué)和血清學(xué)檢測方法又存在操作繁雜、費時費力、敏感性低等不足。多重PCR（multiplex PCR，mPCR）診斷方法可以對病原菌進行全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測與鑒定，且操作簡單、快速，具有很高的特異性和靈敏度，檢測成本低，適合大量臨床樣品 （特別是混合感染樣品）中病原體的快速診斷，從一份樣品中同時檢測出多種病原體[6]。

本研究擬建立一種能同時檢測CP、E.coli、SE、Pm的多重PCR方法，對臨床樣品進行簡便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的檢測，為綿羊細菌性腹瀉病的防制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)氣莢膜梭菌 A型 （CVCC41）、產(chǎn)氣莢膜梭菌 B型（CVCC1145）、產(chǎn)氣莢膜梭菌C型 （C59-30）、產(chǎn)氣莢膜梭菌D型 （CVCC84）、產(chǎn)氣莢膜梭菌E型 （E型魏氏梭菌）、多殺性巴氏桿菌 （CVCC494）、大腸桿菌 （CVCC1542）、大腸桿菌（CVCC215）均購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；腸炎沙門氏菌 （SE）、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、結(jié)核桿菌為貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室保存。

1.2 主要試劑

Goldview I型核酸染色劑、D2000、EDTA、Tris、Taq DNA Polymerase （5U/μL） 及相應(yīng) 10×Taq Buffer、 dNTP 等購自寶生物 （大連）工程有限公司。TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒、TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物由寶生物 （大連）工程有限公司合成。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中登錄的產(chǎn)氣莢膜梭菌 （CP）α毒素基因、大腸桿菌 （E.coli）K99菌毛毒力因子、腸炎沙門氏菌 （SE）外膜蛋白A基因 （ompA）、多殺性巴氏桿菌 (Pm)K基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件，設(shè)計了4對引物，用于擴增CP、E.coli、SE、Pm目的基因片段，引物的序列 （見附表）。

1.4 細菌基因組抽提

待檢樣品如腸內(nèi)容物、新鮮糞便等組織樣品的提取參照TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒說明書進行；細菌DNA的提取參照TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行，將提取的DNA于-70℃保存。

1.5 單一細菌PCR擴增

單一細菌的PCR反應(yīng)在25μL體系中進行，Primer1/2各2μL、 10×Taq Buffer 5μL、 dNTP mixture 4μL、 Taq DNA polymerase0.5μL、 ddH2O 加至 25μL， 反應(yīng)程序： 94℃ 5min； 94℃30s， 53℃ （CP）、 52℃ （E.coli）、 55℃ （SE）， 55℃ （Pm） 40s，72℃40s，30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。取8μLPCR擴增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

附表 引物序列

1.6 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

對多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，包括退火溫度 （52～56℃），引物濃度 （5～20μmol/L）， Taq DNA polymerase濃度 （0.5～3.5U），以確定最佳反應(yīng)條件，同時以雙蒸水作為空白對照。采用100μL 反應(yīng)體系， 即 10×Taq Buffer 20μL， dNTP mixture 16μL；Taq DNA polymerase 2μL，用雙蒸水補足至100μL。反應(yīng)條件為： 94℃ 5min； 94℃ 1min， 52～56℃ 1min， 72℃ 1min， 30 個循環(huán)；最后72℃延伸7min。取8μL PCR擴增產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

1.7 敏感性試驗

將提取的細菌組DNA用蛋白質(zhì)核酸儀測定濃度后，人為將4種細菌DNA混合，經(jīng)5倍系列稀釋的細菌DNA用于多重PCR反應(yīng)；經(jīng)10倍系列稀釋的細菌DNA用于單一細菌的PCR反應(yīng)。

1.8 特異性試驗

以CP、E.coli、SE、Pm為模板進行多重PCR反應(yīng)。

1.9 重復(fù)性試驗

應(yīng)用建立多重PCR方法，重復(fù)檢測CP、E.coli、SE、Pm單一細菌DNA或人為混合DNA樣品3次以檢驗結(jié)果的可靠性。

1.10 多重PCR對臨床樣品的檢測

對2015～2017年貴州省畢節(jié)地區(qū)10個規(guī)模化養(yǎng)羊戶和養(yǎng)羊?qū)I(yè)戶采集的1094份病料進行檢測。細菌DNA的抽提參照1.4，同時進行多重PCR和單一細菌PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的鑒定

CP、E.coli、SE、Pm的PCR擴增片段經(jīng)膠回收，送大連寶生物工程有限公司測序，結(jié)果表明，擴增片段分別為各細菌的特異性條帶。

2.2 多重PCR反應(yīng)

在100μL反應(yīng)體系中，多重PCR的最佳反應(yīng)條件為：退火溫度53℃，Taq DNA polymerase1U，引物濃度10μmol/L。用產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌的特異性引物均有效擴增出了其目的片段，分別為258bp、151bp、384bp和585bp，無非特異性片段產(chǎn)生。

2.3 敏感性試驗

在多重PCR反應(yīng)中，細菌DNA最低檢測量分別為羊魏氏梭菌6.0ng/L、大腸桿菌4.0ng/L、腸炎沙門氏菌0.4ng/L、多殺性巴氏桿菌4.0ng/L。在單一細菌的PCR反應(yīng)中，各細菌的最低檢測量分別為羊魏氏梭菌0.6ng/L、大腸桿菌0.4ng/L、腸炎沙門氏菌0.04ng/L、多殺性巴氏桿菌0.4ng/L。

2.4 特異性試驗

以銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、結(jié)核桿菌為模板分別進行多重PCR反應(yīng)均未擴增出條帶，而CP、E.coli、SE、Pm混合DNA均擴增出各細菌的特異性條帶。

2.5 重復(fù)性試驗

應(yīng)用建立的多重PCR方法，重復(fù)檢測CP、E.coli、SE、Pm單一DNA或混合DNA樣品3次，結(jié)果均一致。

2.6 多重PCR對臨床樣品的檢測

利用建立的CP、E.coli、SE、Pm多重PCR及單一細菌PCR方法對1094份臨床病料進行檢測。1094份病料中有189份 CP陽性，陽性率最高，為17.27% （189/1094）；175份E.coli陽性，陽性率為15.99% （175/1094）；101份SE陽性，為 9.23% （101/1094）； 33份 Pm 陽性， 為 3.01% （33/1094）。其中CP、E.coli、SE混合感染15份；CP、E.coli混合感染43份；E.coli、SE混合感染29份。其結(jié)果與單一細菌PCR檢測結(jié)果的符合率為100%。

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌等病嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，其共同致病特征均能導(dǎo)致綿羊細菌性腹瀉。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)成為眾多病原檢測和分析的主要手段。本研究建立的多重PCR可以在同一個反應(yīng)體系中同時檢測4種細菌，能對臨床樣品中CP、E.coli、SE、Pm單獨或混合感染進行快速、準(zhǔn)確的檢測及鑒定，結(jié)果表明，該診斷方法敏感性好、特異性高，具有廣闊的應(yīng)用前景，在某種程度上還可以為研究這4種細菌之間在羊群中感染關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌最主要的毒素和致病因子之一[7,8]，其編碼基因 (α-toxin)存在于所有型的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組中。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的毒力因子主要有菌毛 （主要有K99、F41、F17）和腸毒素。其中K99菌毛蛋白具有黏附于小腸絨毛上皮刷狀緣的K99菌毛特異性的受體，使細菌牢固地定居于小腸黏膜上，從而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生，并具有良好的免疫原性[9]；腸炎沙門氏菌opmA又稱熱修飾蛋白，是腸炎沙門氏菌的主要外膜蛋白，在維持外膜結(jié)構(gòu)上具有重要作用，且序列高度保守，具有良好的免疫原性[10]。Townsend等認(rèn)為多殺性巴氏桿菌的KMT1基因在所有多殺性巴氏桿菌中均存在，是多殺性巴氏桿菌獨有的序列，即KMT1基因是多殺性巴氏桿菌的一個種特異性基因，KMT基因是Pm種特異性的DNA片段[11]。

多重PCR中引物的設(shè)計至關(guān)重要，本研究設(shè)計的引物是針對4種細菌各自相對保守的基因序列，分別是產(chǎn)氣莢膜梭菌（CP）α毒素基因、大腸桿菌 （E.coli）K99菌毛毒力因子、腸炎沙門氏菌 （SE）外膜蛋白A基因 （ompA）、多殺性巴氏桿菌(Pm)K基因序列。在這4種細菌中，SE G+C含量較高，在設(shè)計引物時，CP、E.coli和Pm這3對引物在相近的退火溫度進行多重PCR擴增是多重PCR反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵。

本研究中建立的多重PCR診斷方法，可以用于臨床檢測，從臨床病料檢測結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸桿菌是引起細菌性腹瀉的主要病因，這也是綿羊細菌性腹瀉病防制的重點，因而免疫接種相關(guān)疫苗有助于降低腹瀉的發(fā)生率。