王晶晶 張 杰 盧 靜

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100069)(2. 首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院臨床流行病學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

心力衰竭(heart failure，HF)是各種嚴(yán)重心臟疾病共有的一個(gè)主要并發(fā)癥或“最后共同通道”。心力衰竭患者一旦出現(xiàn)典型癥狀，病情將進(jìn)行性加重，死亡率與惡性腫瘤病人相仿[1-2]，但目前對(duì)于其機(jī)制、診斷和治療的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的不正常凋亡在心衰中起著重要的作用[3-4]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是使心肌細(xì)胞不正常凋亡的新途徑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠急性心肌梗死模型,觀察心肌梗死后心力衰竭大鼠8周內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性分子伴侶的表達(dá)變化與心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系,探討急性心肌梗死后大鼠心力衰竭的過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在心肌細(xì)胞凋亡中的作用，從而為心衰病人的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立

SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量200～220 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001；飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2013-0004。

動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組，手術(shù)組。假手術(shù)組僅進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)，不結(jié)扎冠脈，隨機(jī)分0周組、2周組、4周組、6周組、8周組，每組存活動(dòng)物不低于5只。手術(shù)組根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-7]的方法，結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)1個(gè)明顯的ST段弓背抬高，心肌梗死模型成功，模型成功率為98%。手術(shù)組術(shù)后隨機(jī)分為術(shù)后2周組、4周組、6周組、8周組共4組，每組存活動(dòng)物不低于5只。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol試劑(Invitrogen公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promege公司)，QPCR試劑盒(ABI公司)、引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

EL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟生物科技有限公司，國(guó)產(chǎn))，熒光定量PCR儀(Bio-RAD公司，IQ5美國(guó))、高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司，德國(guó))。

1.3 方法

1.3.1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定：分別測(cè)定假手術(shù)組各組在0周、2周、4周、6周、8周的心率(HR)；左心室壓力最大上升速率(dp/dt max)；左心室最大下降速率(-dp/dt max)；左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)；測(cè)定手術(shù)組術(shù)后2周組、術(shù)后4周組、術(shù)后6周組、術(shù)后8周組大鼠在2周、4周、6周、8周的心率(HR)；左心室壓力最大上升速率(dp/dt max)；左心室最大下降速率(-dp/dt max)；左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)。

1.3.2心肌組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：手術(shù)組術(shù)后2周組、4周組、6周組、8周組大鼠分別于術(shù)后2周、4周、6周、8周處死并取其心肌組織；假手術(shù)組大鼠分別在0周、2周、4周、6周、8周處死并取其心肌組織。采用Trizol試劑[6-7]分別提取假手術(shù)組各組大鼠、手術(shù)組各組大鼠的心肌組織中總RNA，利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將心肌總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.3引物設(shè)計(jì)：引物根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因組序列，利用生物學(xué)軟件Primer5.0自行設(shè)計(jì)。

表1 引物序列

1.3.4熒光定量PCR法(QPCR)測(cè)定Caspase-3, Caspase-12, Bcl-2，CHOP, GRP78在心肌組織中的的表達(dá)量：利用QPCR反應(yīng)試劑盒(SYBR GREEN法)采用20 μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95℃10 s，55℃30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物應(yīng)用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析得到相關(guān)的光密度值。每個(gè)樣本做3平行樣，最后取基因或蛋白的光密度值與相應(yīng)的β-actin光密度值的比值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間的數(shù)據(jù)比較采用S-N-K 檢驗(yàn)，蛋白及基因的表達(dá)量與時(shí)間的相關(guān)性分析采用Speaman相關(guān)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定

假手術(shù)組大鼠2、4、6、8周的血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)與該組0周時(shí)的相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2；手術(shù)組大鼠的心率隨著飼養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸加快，術(shù)后2周、4周、6周、8周組大鼠左心室收縮壓(LVSP)與假手術(shù)組的相比有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)；手術(shù)組大鼠術(shù)后2周、4周、6周、8周組的左心室收縮壓(LVEDP)與假手術(shù)組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)；手術(shù)組術(shù)后2周組與假手術(shù)組大鼠的左心室壓力最大上升速率(+dp/dt max)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)，手術(shù)組大鼠術(shù)后4周、6周、8周組與假手術(shù)組的左心室壓力最大上升速率(+dp/dt max)相比有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)；手術(shù)組術(shù)后2周組與假手術(shù)組大鼠的左心室壓力最大下降速率(-dp/dt max)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)，手術(shù)組大鼠術(shù)后4周、6周、8周組與假手術(shù)組大鼠的左心室壓力最大下降速率(-dp/dt max)相比有顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 不同組的大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3, Bcl-2，CHOP, GRP78的表達(dá)

手術(shù)組大鼠術(shù)后2、4、6、8周組心肌組織中Caspase-12的表達(dá)量隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)；手術(shù)組大鼠術(shù)后2、4、6、8周組心肌組織中Caspase-3的表達(dá)量隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加，術(shù)后4、6周組與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)，術(shù)后2、8周與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)；大鼠手術(shù)組術(shù)后2、4、6、8周組心肌組織中Bcl-2的表達(dá)量隨著術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，2、4、6、8周組與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P≤0.01)；大鼠術(shù)后2、4、6、8周組心肌組織中CHOP的表達(dá)量隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加，術(shù)后2、4周組與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)，術(shù)后6、8周組與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)；大鼠手術(shù)組術(shù)后2、4、6、8周組心肌組織中GRP78蛋白的表達(dá)量隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加，術(shù)后6周組與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)；術(shù)后8周組心肌組織中的GRP78蛋白含量與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間的血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

注：A：與假手術(shù)組比P≤0.05； AA：與假手術(shù)組比P≤0.01 Note：A:P≤0.05vssham group, AA:P≤0.01vssham group

表4 各組大鼠心肌組織基因/蛋白含量表達(dá)

注：A：與假手術(shù)組比P≤0.05； AA：與假手術(shù)組比P≤0.01 Note：A：P≤0.05vssham group，AA：P≤0.01vssham group

2.3 術(shù)后飼養(yǎng)2、4、6、8周與手術(shù)組大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3, Bcl-2，CHOP, GRP78含量的相關(guān)性

手術(shù)組大鼠心肌組織中Caspase-12, Caspase-3，CHOP, GRP78的表達(dá)量隨著術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，其表達(dá)量與時(shí)間呈正相關(guān)，心肌組織中Bcl-2的表達(dá)量隨著術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而減低，其表達(dá)量與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 大鼠術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)間與大鼠心肌組織中蛋白/基因表達(dá)量的相關(guān)性

3 討論

心力衰竭是心臟結(jié)構(gòu)與功能嚴(yán)重減退的臨床表現(xiàn)，然而對(duì)心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍未完全闡明。急性心肌梗死后心肌細(xì)胞的死亡會(huì)導(dǎo)致心室重塑和心力衰竭，而心室重構(gòu)的發(fā)生與心肌細(xì)胞凋亡又有著重要聯(lián)系。研究顯示心肌細(xì)胞凋亡在心肌梗死后心室重塑和心衰發(fā)展中發(fā)揮重要作用,而心肌細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生又密切相關(guān)[8-9]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，當(dāng)機(jī)體受到如缺氧、中毒、電解質(zhì)酸堿平衡紊亂等刺激時(shí)，其相應(yīng)的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)蛋白將會(huì)被激活，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)合成功能，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10-11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期,是通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)保護(hù)由ERS引起的細(xì)胞損傷，恢復(fù)細(xì)胞功能恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞的正常功能并使之生存，是細(xì)胞的一種自我保護(hù)性機(jī)制。

UPR是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/Bip (glucose-regulated protein78/binding immunoglobulin protein)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上PERK、ATF6、IRE1應(yīng)激感受蛋白所介導(dǎo)發(fā)生的。正常情況下GRP78與PERK、ATF6、IRE1連接呈無(wú)活性狀態(tài)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚大量未折疊蛋白時(shí),GRP78與三者解離，激活PERK、ATF6、IRE1，啟動(dòng)UPR反應(yīng)，從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。因此GRP78在應(yīng)激條件下對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用,而它的誘導(dǎo)產(chǎn)生則被廣泛用于標(biāo)志ERS和UPR的發(fā)生[12]。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死后心力衰竭的大鼠心肌組織中GRP78蛋白持續(xù)表達(dá)，并隨著術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，心力衰竭的嚴(yán)重程度增強(qiáng)。這說(shuō)明在急性心肌梗死到心力衰竭的病理過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)被激活。這可能是由于急性心肌梗死的大鼠在發(fā)展成慢性心力衰竭的過(guò)程中，隨著大鼠心肌細(xì)胞的缺血，心臟輸出量降低，心臟功能減弱，使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷逐漸加重，從而誘導(dǎo)了ERS和UPR反應(yīng)的發(fā)生。

大鼠在發(fā)生急性心肌梗死后發(fā)展到心力衰竭的過(guò)程中，體內(nèi)的ERS持續(xù)存在，過(guò)強(qiáng)或過(guò)久的ESR，使得UPR的保護(hù)作用不能與ESR帶來(lái)的損傷相抗衡。由于不能通過(guò)UPR的啟動(dòng)恢復(fù)細(xì)胞正常功能，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與ERS相關(guān)的跨膜蛋白信號(hào)將會(huì)激活下游的凋亡信號(hào)分子：Caspase-12，GADD153/CHOP(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153或C/EBP homologous protein)，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[13]。已有的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是除了線粒體外，另一條誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的新途徑，過(guò)強(qiáng)的或長(zhǎng)時(shí)間的ERS反應(yīng)可以引起細(xì)胞凋亡[14-15]。

Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜獨(dú)有的蛋白水解酶，特異性結(jié)合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。正常情況下以無(wú)活性的前提存在，當(dāng)發(fā)生ESR時(shí)Caspase-12被激活，進(jìn)而激活下游的Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證明Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的特異性分子，是不通過(guò)線粒體凋亡途徑的獨(dú)立信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的[15-16]，因此可以把Caspase-12的活化作為ERS途徑細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[15]。

而GADD153/CHOP是b-ZIP轉(zhuǎn)錄因子,屬于CCAATP增強(qiáng)子連接蛋白的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP家族，在正常生理狀態(tài)下CHOP基本檢測(cè)不到，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或程度過(guò)重時(shí)，其活性被顯著激活，引發(fā)高水平的ERS[16]。 因此CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志，它是是通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)、耗竭谷胱甘肽、促進(jìn)反應(yīng)氧族產(chǎn)生等導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)心肌梗死后心力衰竭的大鼠術(shù)后2周、4周、6周、8周組的心肌組織中Caspase-3,Caspase-12，CHOP 的表達(dá)量隨著術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，心力衰竭的嚴(yán)重程度而增加。Bcl-2的表達(dá)量隨著術(shù)后飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，心力衰竭的嚴(yán)重程度而減少。這說(shuō)明大鼠從心肌梗死發(fā)展到心力衰竭的過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上始終有ESR的發(fā)生。持續(xù)存在的ESR，使與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡信號(hào)分子被激活，引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞凋亡貫穿于心肌梗死到心力衰竭的整個(gè)過(guò)程。

綜上所述，大鼠從急性心肌梗死發(fā)展到心力衰竭的病理生理過(guò)程誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，持續(xù)、嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡通路，使得心肌細(xì)胞凋亡。提示ERS參與了大鼠從急性心肌梗死到心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用可能是心肌梗死后導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生的機(jī)制之一。