余幫興 梁文斌 王 文

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實驗動物室，北京 100053)(2. 武漢市武東醫(yī)院、武漢市第二精神病醫(yī)院外科， 武漢 430084)

Western blot技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達[1-3]，該實驗技術(shù)步驟繁瑣。急性心肌梗死是一個嚴重威脅人類的高死亡率的疾病。炎癥在急性心肌梗死損傷與修復(fù)中有著重要的作用[4]。本文探討Western blot在大鼠心肌缺血炎性因子研究中的應(yīng)用：

1 材料與方法

1.1 材料

研究用的抗體及化學(xué)試劑等：IL-6(abcam,ab9324)，TNF-α(abcam,ab11564)，IL-1β(abcam, ab9722)，GAPDH(CST,#5174)，NF-κB p65(abcam,ab19870)，NF-κB p65(CST8242)，二抗(中杉金橋ZB2301、ZB2305, ZSGB-BIO, 中國)，RIPA裂解液(強)(碧云天公司)等。

1.2 實驗儀器

小動物呼吸機；多導(dǎo)生理信號記錄儀； Bio-Rad電泳儀；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)等。

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠,體質(zhì)量250～280 g，北京維通利華公司購入，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.4 方法

1.4.1心肌缺血造模[5]:6-0帶線縫合針結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支(LAD)，造模成功后3 d摘取大鼠心臟，轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱。

1.4.2樣品制備:用眼科剪快速剪碎心臟左心室組織，按1∶6的比例加裂解液RIPA，再加1%PMSF(1 mL RIPA加10 μL PMSF)，靜置半小時以上，先機械勻漿至沒有明顯的大顆粒，再超聲粉碎至沒有沉淀，所有步驟均需在冰上操作，以防止蛋白質(zhì)變性。12 000 r/min 30 min離心取上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中。離心機應(yīng)提前預(yù)冷至4 ℃。

1.4.3定蛋白(BCA法): BCA定量法(參考普利萊公司BCA試劑盒說明書)，所有步驟均需在冰上操作。定蛋白過程如下：8個EP管分別標記1 600、800、400、200、100、50、25、0(盡量用小的EP管，這樣誤差小，標準曲線才可能更準確)，第一個EP管90 μL ddH2O，余下每個EP管均80 μL，然后第一個1 600 EP管加60 μL BSA標準品，以渦旋器上最大渦旋速度渦旋1 600 EP管并用移液器反復(fù)吹打，以保證蛋白在ddH2O中充分混勻，然后吸1 600 EP管中物80 μL入800EP管中，渦旋器上最大渦旋速度渦旋EP管并移液器反復(fù)吹打；吸800EP管中物80 μL入400EP管中，依此類推至25EP管，最后一個EP管僅含ddH2O。倍比稀釋每步均需充分渦旋并用移液器反復(fù)吹打。樣本按表1稀釋。

表1 標準品BSA及樣品稀釋方法

注:之具體含義參見文中詳細描述 Note:described in detail in this paper

工作液(WR)配制： 1 mL BCA Reagent+20 μL Cu Reagent為WR(多配點，保證夠用)，呈綠色。

96孔板中每孔加25 μL稀釋后的BSA及樣本溶液，然后每孔按200 μL加工作液(WR)。96孔板搖床上37 ℃ 30 min。用酶標儀(波長562 nm)測A值(2個復(fù)孔)。

Microsoft Excel 軟件上操作：散點圖 → 標準曲線 →A平均值 → 蛋白濃度→ 樣品體積μL(以最低蛋白濃度為準×100/蛋白濃度)→ 加裂解液體積μL(100-樣品體積)。 加5×loading buffer 25 μL(即變成1×LB)，95 ℃ 10 min變性。舉例如表2、圖1、表3。

圖1 標準品BSA標準曲線

表2 標準品BSA倍比稀釋后A值結(jié)果

表3 100 μL變性前樣品(原樣品體積及應(yīng)加入裂解液體積)

注：75.2=33030/439.1,81.3=33030/406.1333

1.4.4灌注凝膠和電泳

第一步：清洗玻璃板

第二步：配膠

①對齊玻璃板,垂直卡緊在Bio-Rad綠色架子上；

②根據(jù)目的蛋白的分子量配不同濃度的分離膠，在分離膠溶液中加入過硫酸銨(AP)、TEMED，立即快速搖動混合并迅速往兩玻璃板的間隙中灌注溶液,至約平綠色架子橫桿下緣處(梳子的齒長再加0.5 cm)。隨后在分離膠上小心加一層雙蒸水[6]。

③約20～30 min后，當雙蒸水和膠之間有一條分界線時，倒去膠上覆蓋的雙蒸水并用濾紙吸凈，注意兩端的水要吸凈。配濃縮膠，加入過硫酸銨(AP)、TEMED后立即搖勻迅速灌膠。灌滿濃縮膠，然后將干凈的梳子迅速插入濃縮膠中。灌膠及插梳子過程中要避免氣泡產(chǎn)生。待到濃縮膠凝固(30～40 min)后，將玻璃板固定于電泳裝置上(小玻璃板朝內(nèi)，大玻璃板朝外)。先在電泳槽的內(nèi)槽加滿電泳液(1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液)，然后雙手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將梳子拔出[6-7]。

第三步：上樣

測完蛋白含量后，計算含50μg蛋白的樣本體積即為上樣量。Marker 上樣量按說明書的推薦量，一般是3～5 μL。微量加樣器吸取樣品，上樣后用雙蒸水清洗微量加樣器，無菌紗布擦凈針頭上的雙蒸水。兩端加等體積的1×Loading buffer，以壓平電泳條帶。

第四步：電泳

將電泳裝置與電源相接，先恒壓60 V，待濃縮成一條直線時改為恒壓90 V(或110～130 V)，電泳至溴酚蘭到達分離膠底部上方約1 cm處時關(guān)閉電源，從Bio-Rad電泳裝置上卸下玻璃板，雙蒸水沖洗玻璃板，撬開玻璃板，切去濃縮膠及多余的分離膠。 剝離剩余的分離膠，轉(zhuǎn)移至1×轉(zhuǎn)膜液中漂洗。

1.4.5轉(zhuǎn)膜:跑膠時準備轉(zhuǎn)膜用品。1×轉(zhuǎn)膜液按1∶2∶7配方，即10×電轉(zhuǎn)液100 mL十200 mL甲醇十700 mL雙蒸水。轉(zhuǎn)膜液提前置于冰中預(yù)冷(此步很重要)。提前將NC膜或PVDF膜、海綿、濾紙一起浸泡入1×轉(zhuǎn)膜液中。

將夾子打開使白的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，在海綿墊上墊2層濾紙，NC膜凹面朝上放于濾紙上(此處要注意NC膜的方向性，否則蛋白質(zhì)不能轉(zhuǎn)移到NC膜上)，將分離膠覆蓋于NC膜上，在膠上蓋2層濾紙，用玻棒搟走里面的氣泡，最后蓋上另一個海綿墊，再次用玻棒搟走里面的氣泡，合起夾子。整個操作在1×轉(zhuǎn)膜液中進行。裝有1×轉(zhuǎn)膜液的器皿整個操作過程均置于冰上。

將夾子放入電轉(zhuǎn)槽中，黑對黑，白對紅。4板膠電轉(zhuǎn)槽中1×轉(zhuǎn)膜液1 000 mL左右。電轉(zhuǎn)時會產(chǎn)熱，過熱有可能造成蛋白質(zhì)的降解，同時大量產(chǎn)熱會使凝膠膨脹，有可能在膠和膜之間產(chǎn)生空隙，引起轉(zhuǎn)膜不均勻，所以在電轉(zhuǎn)槽中要放冰袋。電轉(zhuǎn)槽的3/4部分整個轉(zhuǎn)膜過程均置于冰水混合液體中。

1.4.6孵育抗體: ①轉(zhuǎn)移膜1×麗春紅中漂洗，蒸餾水中漂洗，剪下目的條帶并作好標記，轉(zhuǎn)至1×TBST液中，搖床上漂洗；②5%(w/v)脫脂奶粉封閉液室溫搖床上封閉目的條帶1 h；③5%(w/v)脫脂奶粉封閉液稀釋一抗，一抗孵育，4 ℃冰箱過夜；④1×TBST漂洗，洗3次，每次10 min；⑤5%(w/v)脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，二抗室溫孵育2 h；⑥1×TBST漂洗，洗3次，每次10 min。

1.4.7ECL化學(xué)發(fā)光凝膠成像:暗室中，將A和B兩種試劑在塑料管中1∶1體積混合，注意不能用同一槍頭吸取A和B試劑，每個目的條帶迅速加約200 μL ECL化學(xué)發(fā)光劑，按照化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)操作說明書曝光，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(AlphaView SA軟件)分析目的條帶和內(nèi)參條帶的凈光密度值。

2 結(jié)果

Western blot實驗結(jié)果：大鼠心肌缺血72 h后炎性因子(IL-6 ,TNF-α, IL-1β)表達增加(圖2和表4),與假手術(shù)組比較，缺血模型組(72 h)炎性因子IL-6, TNF-α顯著增加(P<0.001) , 結(jié)果表明IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子參與了大鼠心肌缺血的病理生理過程，炎癥加重心肌缺血損傷。

表4 大鼠心肌缺血前、心肌缺血后72 h炎性因子表達水平

注：數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，model vs. sham，#p<0.05，###p<0.001，n=6 Note: Mean±SEM, model vs. sham,#p<0.05,###p<0.001,n=6

圖2 大鼠心肌缺血72 h后炎性因子(IL-6 ,TNF-α, IL-1β)表達增加炎性因子參與大鼠心肌缺血的病理生理過程

3 討論

Western blot為常用的檢測蛋白質(zhì)的方法，其操作步驟較多[8]，大鼠心肌缺血炎性因子Western blot操作應(yīng)該注意以下問題：①開胸摘取的心臟迅速置于0.9%生理鹽水中，離開大鼠的心臟在0.9%生理鹽水中仍能跳動并搏出心腔內(nèi)的血液，待大鼠心臟搏動減弱時迅速置于另一個0.9%生理鹽水器皿中，直至生理鹽水顏色變淡，以避免紅細胞對A值的影響；②在冰袋上用眼科剪快速剪去左右心房、大血管及右心室大部分，將剩余的大鼠心臟組織一分為二(一份后續(xù)實驗，一份備份)，吸水紙(或無菌小紗布塊)將大鼠心臟組織水分吸干凈，樣本錫箔紙包裹(編號)存放于液氮罐中，待取材完畢轉(zhuǎn)到-80 ℃冰箱存放；③加裂解液RIPA的比例問題：大鼠心肌炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB)豐度低，Western blot預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)按1∶6～7的比例較好，若按1∶5的比例裂解，條帶易顯示，但內(nèi)參GAPDH條帶濃且易連成一條線，若按1∶9的比例裂解，條帶不易顯示；④一旦實驗計劃裂解心肌，需連續(xù)實驗至95 ℃ 10 min變性完畢這一步，實驗不要中斷，否則蛋白質(zhì)易降解，導(dǎo)致內(nèi)參GAPDH條帶不齊；⑤電泳槽的內(nèi)槽應(yīng)先加滿電泳液并觀察電泳槽內(nèi)槽底端是否有電泳液漏出，若有電泳液漏出，則需重新夾緊玻璃板，作者實驗時曾出現(xiàn)過電泳完畢溴酚蘭不成一條直線而呈拱形，發(fā)現(xiàn)是因為電泳槽內(nèi)槽漏液所致；⑥轉(zhuǎn)膜液一定要提前充分預(yù)冷。電轉(zhuǎn)槽的3/4部分整個轉(zhuǎn)膜過程均必需置于冰水混合液體中。10 min后電轉(zhuǎn)槽接通電源較好，此有利于整個轉(zhuǎn)膜體系溫度能夠提前降下來，低溫關(guān)系到轉(zhuǎn)膜的成?。虎叽笫笮募⌒》肿恿垦仔砸蜃?IL-1、IL-6、TNF-α)Western blot轉(zhuǎn)膜條件為恒流250mA、1 h較好[9-10]，而大鼠心肌炎性因子(NF-κB，65kD，CST8242)Western blot轉(zhuǎn)膜條件為恒流400mA、1 h較好；⑧孵育一抗后以及孵育二抗后TBST洗膜，洗3次，每次10 min，這是最低要求，如果背景不干凈，建議增加TBST洗膜次數(shù)；⑨內(nèi)參是Western blot不可或缺的，如果Western blot內(nèi)參做不出，實驗無法進行下去。內(nèi)參一般選擇管家基因編碼表達的蛋白，如β-actin、tubulin、GAPDH等。作者在檢測大鼠心肌蛋白時選用GAPDH作為內(nèi)參。如果Western blot實驗，建議首先做一次所有標本的GAPDH，內(nèi)參條帶如果不齊，建議重新定蛋白；⑩選擇好的一抗至關(guān)重要，盡量選擇單克隆抗體而不是多克隆抗體。