王飛飛，傅玲琳，鮑星月，劉長軍，張曉雙，王彥波,*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江 杭州 310018；2.象山縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 象山 315700）

研究表明細菌是引起食品腐敗變質(zhì)的重要原因，據(jù)統(tǒng)計全球約1/4的食品損失是由細菌等微生物單獨活動引起的[1]，其導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟損失和嚴重的公共衛(wèi)生問題。自20世紀30年代以來，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)大多食源性致病菌能形成生物被膜，可以存在于食品加工廠包括塑料、玻璃、金屬和木材等各種表面；也可以在食品運輸和貯藏過程中形成，黏附在固體表面[2]。細菌在形成生物被膜后對化學(xué)殺菌劑和環(huán)境變化的敏感程度顯著降低，耐熱性也相應(yīng)增加，可引起顯著的食品安全問題，最終導(dǎo)致嚴重的健康問題和經(jīng)濟損失[3]。

研究表明細菌有兩種關(guān)鍵的小分子信號通路，包括群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)和環(huán)二鳥苷酸（cyclic di-guanosine monophosphate，c-di-GMP）系統(tǒng)，其在多種細菌的一系列生理功能中都起著重要調(diào)控作用，包括胞外酶分泌、毒力調(diào)節(jié)、生物被膜形成和細胞運動性等[4]。此外，近年來越來越多的研究報道了QS對食品腐敗的調(diào)控作用。QS通過自誘導(dǎo)物（autoinducers，AIs）的分泌、釋放、感應(yīng)來調(diào)控細胞密度依賴的基因表達，使細胞的基因表達從低細胞密度的個體生活方式轉(zhuǎn)換為協(xié)同的高細胞密度狀態(tài)[5]。c-di-GMP系統(tǒng)可以將包括分子氧、氨基酸、電子、光子等環(huán)境刺激轉(zhuǎn)化為c-di-GMP信號[6]，并由其效應(yīng)分子核糖開關(guān)或/和受體蛋白介導(dǎo)調(diào)控基因表達完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。食源性細菌通過胞外AIs和胞內(nèi)c-di-GMP這兩大類小分子信號來調(diào)控其生存狀態(tài)，從而影響食品的品質(zhì)和安全。目前，有關(guān)QS和c-di-GMP信號通路的研究主要集中在醫(yī)藥和生物防治領(lǐng)域，在食品領(lǐng)域仍待進一步探究，鑒于此，本文綜述食源性細菌關(guān)鍵小分子信號通路研究進展，旨在提供保障食品品質(zhì)和安全的控制靶點。

1 食源性細菌關(guān)鍵小分子信號通路概述

1.1 細菌QS概述

研究發(fā)現(xiàn)，細菌會通過細胞間的相互交流控制一系列的生命活動。細菌在生長過程中通過QS來調(diào)控相關(guān)基因的表達以促使自身更好地適應(yīng)外界環(huán)境。QS依賴于被稱為AIs的信號分子的產(chǎn)生、分泌及應(yīng)答，信號分子隨著細菌的生長在一定基礎(chǔ)水平上繼續(xù)產(chǎn)生和分泌，從而使環(huán)境介質(zhì)中信號分子濃度達到一個閾值水平（即群體水平），并與細胞膜上或胞內(nèi)的受體結(jié)合進而調(diào)控QS依賴的目的基因表達來誘導(dǎo)相應(yīng)表型[8]，這種細胞間的相互溝通方式被稱為QS。目前，可將已經(jīng)鑒定到的信號分子歸為4大類：一是?；呓z氨酸內(nèi)酯（acylhomoserine lactone，AHL），其是一種脂肪酸的衍生物，被統(tǒng)一稱為AI-1，產(chǎn)生于革蘭氏陰性菌中，主要參與種內(nèi)信號交流；二是呋喃硼酸二酯，產(chǎn)生于S-腺苷高半胱氨酸到同型半胱氨酸的循環(huán)過程中，被統(tǒng)稱為AI-2，可同時由革蘭氏陰性菌和陽性菌產(chǎn)生，并參與種內(nèi)和種間的信號傳遞；三是AI-3，首次在腸出血性大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)，參與調(diào)控毒性因子的產(chǎn)生；四是自誘導(dǎo)多肽（autoinducing peptides，AIPs），存在于由革蘭氏陽性菌中[9]。細菌大多數(shù)QS調(diào)節(jié)的生理過程都是為了確保在一定環(huán)境下更高的存活率[10]。

大多數(shù)細菌利用兩種機制來檢測AIs并作出響應(yīng)，從而調(diào)控靶向基因的表達。第一種機制以依賴AHL的QS系統(tǒng)為代表，存在于革蘭氏陰性菌中，AHL由LuxI型AHL合成酶產(chǎn)生，其受體是LuxR家族轉(zhuǎn)錄因子。LuxR-AHL復(fù)合物是一個二聚物，與受QS調(diào)控的啟動子保守回文序列結(jié)合，包括luxI自身的啟動子，激活A(yù)HL的產(chǎn)生（自誘導(dǎo)）以及其他靶基因的表達。在另一種機制中，信號分子則由膜雙組分應(yīng)答調(diào)節(jié)系統(tǒng)檢測到，同時存在于革蘭氏陰/陽性菌中[11]，如葡萄球菌屬（Staphylococcus）產(chǎn)生的信號多肽AIP。在該系統(tǒng)中，信號分子由膜上的感應(yīng)器檢測并將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)子，通過調(diào)節(jié)性RNAs和轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控靶基因表達[12]。哈氏弧菌（Vibrio harveyi）的QS系統(tǒng)卻同時具備革蘭氏陰性菌和陽性菌的特征，既可以像革蘭氏陰性菌那樣產(chǎn)生并應(yīng)答高絲氨酸內(nèi)酯，也可以像革蘭氏陽性菌那樣通過膜結(jié)合的組氨酸激酶來實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。

1.2 細菌c-di-GMP概述

細菌c-di-GMP最初作為木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinum）中纖維素合酶的變構(gòu)激活劑而被發(fā)現(xiàn)[13]。c-di-GMP由兩個三磷酸鳥苷分子在二鳥苷酸環(huán)化酶（diguanylate cyclase，DGC）作用下合成，DGC包含由大約170 個氨基酸組成的GGDEF結(jié)構(gòu)域[14]。相反地，c-di-GMP被特異性磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）降解，PDE包含由大約250 個氨基酸組成的EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域[15]。與QS機制不同的是，c-di-GMP有著多重信號通路，很多細菌都能編碼大量合成和降解c-di-GMP的蛋白，比如大腸桿菌K-12（Escherichia coli K-12）能編碼12 個含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的蛋白，10 個含有EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白，以及7 個同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白[16]。其次，在細菌基因組中編碼GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的數(shù)量是高度可變的，從不編碼到編碼100多個蛋白不等。雖然這些結(jié)構(gòu)域都是保守的，每個蛋白都有其獨特的N-末端感知域用來接收外界不同信號[17]。

目前已確認c-di-GMP在生物體內(nèi)主要通過效應(yīng)蛋白和mRNA核糖開關(guān)發(fā)揮作用。效應(yīng)蛋白包括含PilZ結(jié)構(gòu)域的蛋白，含有退化的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[18]。mRNA核糖開關(guān)指mRNA 5’非編碼區(qū)的特定保守序列折疊成一定的構(gòu)象，能專一性地與c-di-GMP結(jié)合并影響蛋白質(zhì)翻譯。在G. xylinum中發(fā)現(xiàn)c-di-GMP能激活BcsA-BcsB纖維素合酶復(fù)合體從而增加胞外多糖基質(zhì)的合成，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)c-di-GMP能與BcsA蛋白C末端的PilZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這也是第一個被實驗證實的c-di-GMP受體蛋白。含PilZ結(jié)構(gòu)域的蛋白分布非常廣泛，例如E. coli中調(diào)節(jié)細菌運動能力的YcgR和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中調(diào)節(jié)胞外藻酸鹽合成的AlgA。退化的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白指含有與GGDEF、EAL或HD-GYP類似的結(jié)構(gòu)域，且不具有合成或降解c-di-GMP活性的蛋白，P. aeruginosa中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控Pel多糖合成的內(nèi)膜蛋白PelD和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控生物被膜中胞外蛋白合成與分泌的LapD都屬于這類蛋白[7]。P. aeruginosa中的FleQ[19]和霍亂弧菌（Vibrio cholerae）中的FlrA[20]都是增強子結(jié)合蛋白，屬于c-di-GMP轉(zhuǎn)錄因子類型的效應(yīng)蛋白。c-di-GMP是重要的細菌第二信使，被認為是各種生物體中形成和維持生物被膜的調(diào)節(jié)中心，控制著細胞在可運動的單細胞狀態(tài)與黏附的多細胞狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換[17]。

2 食源性細菌關(guān)鍵小分子信號通路對食品腐敗的調(diào)控

近年來，關(guān)于QS對食品腐敗調(diào)控方面的研究越來越多，目前已在各類食品中檢測到QS信號分子，包括牛奶和乳制品、肉和肉制品、海鮮和水產(chǎn)品、水果和蔬菜等。此外，QS對食品腐敗的調(diào)控也在一些研究中得到驗證。而細菌胞內(nèi)小分子信號c-di-GMP對食源性細菌腐敗特性的調(diào)控及其機制還鮮有研究。以下將圍繞QS與食品腐敗展開討論。

牛奶中腐敗菌Pseudomonas spp.、Serratia spp.、腸桿菌屬（Enterobacter spp.）和Hafnia alvei的致腐能力與QS有關(guān)[21]。從包裝鱈魚片中檢出的N-（3-羥基）-L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-(3-hydroxyoctanoyl)-L-homoserine lactone，3-OH-C8-HSL）能夠調(diào)節(jié)明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）和氣單胞菌屬（Aeromonas spp.）的幾丁質(zhì)酶活性，表明AHL型QS系統(tǒng)可能在甲殼類動物的腐敗中發(fā)揮作用[22]。從熏制鮭魚里分離出來的變形斑沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）B5a菌株，其胞外酶活性受AHL信號分子調(diào)節(jié)[23]。同樣地，N-丁?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-butanoyl-L-homoserine lactone，C4-HSL）能增加嗜冷假單胞菌（Pseudomonas psychrophila）PSPF19菌株胞外酶的產(chǎn)量并提高其在冷藏淡水魚中的致腐能力[24]。另外，豆芽的細菌性腐敗也受QS系統(tǒng)影響[25]。從生鮮蔬菜加工線分離的樸立茅次沙雷菌（Serratia plymouthica）RVH1菌株中的LuxI的同系物SplI，負責(zé)調(diào)控C4-HSL、N-己酰-L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-hexanoyl-L-homoserine lactone，C6-HSL）和N-（3-O-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone，3-oxo-C6-HSL）的產(chǎn)生。S. plymouthica胞外幾丁質(zhì)酶、核酸酶以及蛋白酶的產(chǎn)生與SplI型的QS系統(tǒng)有關(guān)[26]。在S. plymouthica RVH1菌株的SplI突變體中，這些胞外酶的產(chǎn)量減少，只有通過添加C6-HSL或3-oxo-C6-HSL才能恢復(fù)[27]。在與黃瓜腐病相關(guān)的黏質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）MG1菌株和沙雷氏菌（Serratia sp.）ATCC 39006菌株中，其與腐敗有關(guān)的胞外酶的分泌分別受SwrI/SwrR QS系統(tǒng)及其同源物質(zhì)C4-HSL、SmaI/SmaR QS系統(tǒng)及其同源物質(zhì)C4-HSL和C6-HSL的調(diào)節(jié)[26,28-29]。最近，一系列環(huán)二肽分子（diketopiperazines，DKPs）在多種革蘭氏陰性菌中被檢出，且被報道具有調(diào)控AHL型QS能力[30]。研究發(fā)現(xiàn)DKPs能促進腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和/或波羅地海希瓦氏菌（Shewanella baltica）生物被膜的形成[31-32]、氧化三甲胺還原酶（trimethylamine N-oxide reductase A，torA）和鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）的基因表達[32]，以及揮發(fā)性鹽基氮、三甲胺、腐胺和胞外蛋白酶的產(chǎn)生[31-33]。因此，DKPs被認為是新型QS信號分子[34]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，S. baltica中DKPs能與LuxR型受體直接結(jié)合從而調(diào)控氧化三甲胺還原酶調(diào)節(jié)蛋白TorS，誘導(dǎo)型鳥氨酸脫羧酶SpeF和鞭毛馬達蛋白PomA的表達，進而影響三甲胺、腐胺和生物被膜的形成。上述研究初步確認了QS系統(tǒng)對食品腐敗菌致腐能力的調(diào)控作用，但QS調(diào)控腐敗菌致腐能力以及生物被膜形成能力的分子機制仍有待進一步研究。

3 食源性細菌關(guān)鍵小分子信號通路對生物被膜的調(diào)控

由食源性疾病引發(fā)的食品問題已成為我國目前主要的食品安全問題，其中，微生物是主要食源性疾病病原。食源性致病菌形成復(fù)雜和多層結(jié)構(gòu)的生物被膜有助于細菌群落在靜止和安全的環(huán)境中生存而不容易被徹底清除，從而使其得到擴散蔓延，影響食品安全。

3.1 細菌QS與生物被膜形成

研究表明無法合成N-（3-O-十二?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL）的P. aeruginosa lasI突變株只能形成平坦、未分化的生物被膜，并且對十二烷基硫酸鈉的分散作用更敏感[35]，該研究首次將QS與生物被膜形成聯(lián)系起來。目前普遍認為QS在食源性細菌生物被膜形成中起著重要作用。

Cloak等在從牛奶和雞湯中分離出來的空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）中檢出了AI-2，并在其基因組中找到了編碼AI-2合成酶的基因luxS[36]。研究發(fā)現(xiàn)C. jejuni的luxS突變株與野生株相比生物被膜形成減少，添加野生株的無菌24 h培養(yǎng)上清液促進了生物被膜的形成[37]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）AHL合成酶ahyI突變株由于不能合成C4-HSL，不能形成成熟的生物被膜。此外，在A. hydrophila中發(fā)現(xiàn)了一個LuxR型受體能與AHL結(jié)合從而調(diào)控ahyR突變株生物被膜的形成，這說明QS能調(diào)控A. hydrophila的生物被膜形成[38]。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）QS系統(tǒng)包括LuxR型受體PlcR和LuxS/AI-2系統(tǒng)，plcR突變株形成的生物被膜比野生株多約4 倍[39]。外源添加AI-2降低了B. cereus野生株生物被膜的形成，添加AI-2到B. cereus已形成的生物被膜中導(dǎo)致被膜分散[40]。因此，PapR和AI-2對B. cereus生物被膜的形成具有負調(diào)控作用。單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）具有LuxS/AI-2系統(tǒng)，其luxS突變株形成的生物被膜比野生株厚4 倍，故AI-2對L. monocytogenes生物被膜形成具有負調(diào)控作用[41]。E. coli QS系統(tǒng)包括LuxS/AI-2系統(tǒng)和LuxR型受體SdiA，外源添加AI-2增加了E. coli K-12野生株的生物被膜形成[42]，SdiA突變株的生物被膜形成比野生株增加好幾倍，外源添加的AHL通過與SdiA受體結(jié)合從而抑制生物被膜形成[43]。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）也有LuxS/AI-2系統(tǒng)，luxS突變株不能形成成熟的生物被膜，當(dāng)進行l(wèi)uxS基因回補時其生物被膜得以恢復(fù)[44]。V. cholerae在高細胞密度時的生物被膜形成主要受LuxR型轉(zhuǎn)錄因子HapR調(diào)控，hapR突變株生物被膜形成增加[45]。創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）luxR型基因smcR突變株的生物被膜形成比野生株增加了大約5 倍[46]。P. aeruginosa有2 套LuxR/LuxI系統(tǒng)，即LasR/LasI和RhlR/RhlI，lasI和rhlI突變株形成的生物被膜較野生株顯著減少[47]，lasI和rhlI突變株中控制基質(zhì)胞外多糖合成的pel操縱子的轉(zhuǎn)錄受到了抑制[48]。此外，6-姜酚可以通過與P. aeruginosa中的3-oxo-C12-HSL競爭結(jié)合LasR受體從而減少生物被膜的形成[49]。以上研究均在一定程度上說明了QS對細菌生物被膜形成的調(diào)控作用，包括正調(diào)控和負調(diào)控。但是有關(guān)QS對食品腐敗菌生物被膜形成的調(diào)控研究仍停留在表型，需要進一步挖掘其調(diào)控分子機制，為消除腐敗菌生物被膜和開發(fā)新型食品保鮮劑提供新思路。

3.2 細菌c-di-GMP與生物被膜形成

細菌c-di-GMP在生物被膜形成中的作用首次在2002年由2 個團隊分別提出，Boles[50]和D’Argenio[51]等分別在副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和P. aeruginosa中通過突變或/和過表達技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響生物被膜形成的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白。目前，胞內(nèi)c-di-GMP濃度與生物被膜形成和細胞運動性之間的相關(guān)性已在多種細菌中被證明，如E. coli、P. aeruginosa、V. cholerae、A. hydrophila等，這些細菌也是食品中常見的致病菌，極易造成食品污染并給消費者帶來不同程度的危害。細菌c-di-GMP普遍抑制細菌運動性并刺激生物被膜形成，刺激細菌黏附素和細胞外基質(zhì)組分的合成，此外，參與某些致病菌急性感染的毒力基因表達被c-di-GMP下調(diào)，而慢性感染通常與高c-di-GMP水平和生物被膜形成相關(guān)[52]。本文圍繞擁有典型c-di-GMP通路的E. coli、P. aeruginosa和V. cholerae展開討論。

3.2.1 E. coli生物被膜形成機制

YhjH是E. coli的一個具有高效PDE活性的蛋白，與DGC活性蛋白YegE和YedQ共同控制E. coli整體c-di-GMP水平，主要負責(zé)調(diào)控細胞運動性[53]。在生長對數(shù)期，YhjH通過保持低水平的c-di-GMP來維持鞭毛運動性，進入穩(wěn)定期后，由于YhjH的表達下調(diào)，c-di-GMP水平增加[54]，使得c-di-GMP效應(yīng)蛋白YcgR活化并與鞭毛馬達相互作用抑制其活性[53,55]。因此，在生長的大腸桿菌細胞中，YhjH通過保持細胞c-di-GMP的濃度低于能夠激活YcgR的閾值水平而在維持細胞運動性方面起著核心作用。另一個c-di-GMP調(diào)節(jié)體系由DGC活性蛋白YdaM和PDE活性蛋白YciR組成，ydaM和yciR基因缺失株嚴重影響csgD轉(zhuǎn)錄，即影響關(guān)鍵生物被膜形成調(diào)節(jié)因子的表達，從而影響卷曲菌毛合成而不影響細胞運動性，這與yegE和yhjH基因缺失株的表型相反[54]。研究表明，YegE/YhjH和YdaM/YciR以級聯(lián)的方式運作共同決定c-di-GMP水平，YciR作為具有雙功能的觸發(fā)酶，其降解c-di-GMP的酶活性功能與通過互作直接抑制YdaM功能相互干涉。因此，當(dāng)胞內(nèi)c-di-GMP水平較高時，YciR顯示PDE活性從而減輕對YdaM的抑制作用，使其能發(fā)揮DGC活性產(chǎn)生c-di-GMP，同時YdaM作為雙功能蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子MlrA直接互作，從而促使csgD轉(zhuǎn)錄，影響生物被膜形成[56]。

3.2.2 P. aeruginosa生物被膜形成機制

在P. aeruginosa中，至少有5 個DGC活性蛋白可以調(diào)控細胞從可運動狀態(tài)到生物被膜形成，分別為WspR、SadC、RoeA、SiaD和YfiN。相反，DGC活性蛋白GcbA和NicD以及PDE活性蛋白DipA、RbdA和NbdA與生物被膜分散有關(guān)[57]。關(guān)于DGC活性蛋白的第一個生化特征研究源自于GGDEF蛋白WspR，WspR通過調(diào)節(jié)胞外多糖的合成來控制生物被膜形成。WspR發(fā)揮作用經(jīng)歷3 個過程：首先，當(dāng)感應(yīng)到表面黏附生長時，Wsp信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物使WspR磷酸化并觸發(fā)c-di-GMP的合成[58]；接著，WspR磷酸化觸發(fā)亞細胞WspR寡聚成簇，進一步增加了DGC的活性[59]；最后，WspR的活性受到c-di-GMP的反饋抑制。除了WspR，另外一個DGC活性蛋白YfiN作為膜錨定蛋白也能促進胞外多糖pel和psl操縱子的表達[60]。在P. aeruginosa中，很多轉(zhuǎn)錄因子被確認為c-di-GMP受體，即能檢測細胞內(nèi)c-di-GMP水平，并將此信息轉(zhuǎn)化，使特定細胞應(yīng)答/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活。當(dāng)胞內(nèi)c-di-GMP水平較低時，F(xiàn)leQ作為增強子結(jié)合蛋白是鞭毛基因表達的主要激活因子[19]，當(dāng)c-di-GMP水平上升時，c-di-GMP與FleQ的結(jié)合將其作為參與產(chǎn)生胞外多糖和黏附素的pel、psl和cdr基因的阻遏物轉(zhuǎn)化為激活劑，從而促進生物被膜的形成[61]。另一個響應(yīng)c-di-GMP的轉(zhuǎn)錄因子是BrlR，BrlR可以通過上調(diào)編碼多藥外排泵基因的表達從而增加生物膜細胞對抗菌劑的抗性[62]。此外，BrlR對c-di-GMP的結(jié)合親和力比FleQ要強，與FleQ相比，BrlR在較低的c-di-GMP水平和生物被膜發(fā)育過程的較早階段發(fā)揮作用[63]。

3.2.3 V. cholerae生物被膜形成機制

在V. cholerae中，c-di-GMP主要通過抑制細胞運動并促進生物被膜基質(zhì)產(chǎn)生來控制生物被膜的形成，總的來說，c-di-GMP隨著細胞密度增加而減少。系統(tǒng)研究表明，缺失DGC活性蛋白CdgD（VCA0697）、CdgH（VC1067）、CdgK（VC1104）或CdgL（VC2285）可以增強其運動性[64]；相反，缺失PDE活性蛋白RocS（VC0653）或CdgJ（VC0137）抑制其運動性[64-65]；而缺失DGC活性蛋白CdgA（VCA0074）、CdgH、CdgK、CdgL、CdgM（VC1376）和VpvC以及PDE活性蛋白RocS、CdpA（VC0130）、CdgJ、MbaA（VC0703）、CdgC（VCA0785）和VC1851的突變株通過影響多聚糖基因vps的表達來調(diào)節(jié)生物被膜的形成[66-67]。c-di-GMP在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控鞭毛相關(guān)基因，F(xiàn)lrA作為P. aeruginosa中FleQ的同源蛋白，是V. cholerae決定細胞運動性的鞭毛生物合成操縱子flrBC的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)其與c-di-GMP結(jié)合后其活性受損，從而使細胞運動性減弱[20]。另外，MshA亞基聚合形成的菌毛控制V. cholerae的表面附著能力，亞基聚合需要由ATP酶MshE提供能量，而MshE的激活需要c-di-GMP的結(jié)合，mshE或mshA基因缺失會使細菌喪失初始表面附著能力，表明c-di-GMP介導(dǎo)的MshA菌毛的合成是生物被膜形成的關(guān)鍵早期步驟[68-70]。c-di-GMP還可以通過與VpsR（VC0665）和VpsT（VCA0952）結(jié)合在轉(zhuǎn)錄水平上激活VPS的生物合成以及其他生物被膜基質(zhì)蛋白的表達[71]。

4 細菌QS與c-di-GMP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

細菌QS和c-di-GMP信號通路在細菌中具有廣泛的保守性，而且在生物被膜形成、毒力因子合成以及其他相關(guān)生理過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這暗示著這兩條信號通路之間存在某種聯(lián)系。V. cholerae作為一種食源性細菌，是研究QS和c-di-GMP的典型菌株，目前對V. cholerae中QS和c-di-GMP通路之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究也比較透徹，鑒于此，本文以V. cholerae為代表討論QS和c-di-GMP通路之間的調(diào)控關(guān)系。

在V. cholerae中，QS對c-di-GMP的調(diào)控體現(xiàn)在多個水平。具有QS調(diào)節(jié)活性的同源（quorum regulatory，Qrr）sRNA可以直接促進編碼DGC活性蛋白VCA0939的mRNA翻譯，而不依賴于中心調(diào)節(jié)子HapR。Qrr sRNA對VCA0939的誘導(dǎo)作用與低細胞密度下更高的c-di-GMP水平相符，但VCA0939缺失株的生物被膜形成情況較野生株無明顯變化，因為僅一個DGC活性蛋白的缺失并不能對一個復(fù)雜的c-di-GMP信號通路造成很大的影響[72]，對于VCA0939的活性還有待進一步研究。Qrr sRNA的下游分子也能影響c-di-GMP的產(chǎn)生，高細胞密度時HapR的表達控制著14個GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白/EAL結(jié)構(gòu)域蛋白和4個HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細胞c-di-GMP水平下降，從而使vps表達下降[73-74]。相反，hapR基因突變導(dǎo)致c-di-GMP水平上升，使菌落形態(tài)發(fā)生從光滑到多皺的轉(zhuǎn)變[74]。低細胞密度時AphA也控制著一系列DGC活性蛋白和PDE活性蛋白的表達[75]。除了在多層面上對c-di-GMP產(chǎn)生的直接調(diào)控，QS和c-di-GMP信號通路能共同合作控制V. cholerae中2 個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AphA和VpsT的表達。c-di-GMP可以通過與受體VpsR結(jié)合形成復(fù)合物從而激活aphA的轉(zhuǎn)錄[76]，由于AphA是低細胞密度下QS的主要轉(zhuǎn)錄因子，而低細胞密度時c-di-GMP水平較高，因此這條通路具有實際意義。研究發(fā)現(xiàn)在aphA的啟動子中有HapR和VpsR的重疊結(jié)合位點，而且兩者的結(jié)合是相互排斥的[77]，這很好地解釋了aphA在低細胞密度時能被c-di-GMP激活，而在高細胞密度時被HapR抑制的情況，從而共同確保AphA在低細胞密度中的表達。與aphA類似，vpsT的表達也同時受HapR和VpsR的調(diào)控，在vpsT的啟動子中發(fā)現(xiàn)了HapR和VpsR的重疊結(jié)合位點[74,76]。由此可知，V. cholerae整合QS和c-di-GMP兩個信號通路形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而將多個環(huán)境信號轉(zhuǎn)化成vpsT和aphA的表達。

除了V. cholerae，QS和c-di-GMP的聯(lián)系在其他食源性細菌中也有相關(guān)闡述。P. aeruginosa中的酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，TpbA）可以對GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白TpbB進行去磷酸化，從而抑制其活性，減少生物被膜形成。TpbA受Las-QS系統(tǒng)調(diào)控，因此，QS對c-di-GMP的產(chǎn)生具有負調(diào)控作用[78]。在A. hydrophila中，過表達DGC活性蛋白對生物被膜形成的誘導(dǎo)依賴于完整的AI-2 QS系統(tǒng)[79]，食源性細菌中QS與c-di-GMP這兩個關(guān)鍵小分子信號分子之間的調(diào)控關(guān)系見圖1，但是這2 個通路是如何互作從而影響生物表型還有待進一步研究。

圖1 食源性細菌關(guān)鍵小分子信號通路QS與c-di-GMP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Regulatory network between QS and c-di-GMP signaling pathways in foodborne bacteria

5 結(jié) 語

細菌活動是引起食品品質(zhì)變化與安全問題的重要原因。雖然在很多變質(zhì)的食物（肉、奶、魚、果蔬等）中檢測到了QS信號分子，意味著QS在調(diào)控食品變質(zhì)中發(fā)揮一定作用，但它們在食物變質(zhì)中所起的確切作用目前尚不明確。對于食源性細菌中QS和c-di-GMP系統(tǒng)在食品腐敗和生物被膜形成方面的作用及其作用機制仍需進一步研究。有研究表明，早前涉及細菌致病機制的QS系統(tǒng)也可能在食品腐敗中發(fā)揮作用，這為研究基于QS的食品腐敗提供一定的參考。對于c-di-GMP通路，在食源性腐敗菌中還鮮有研究，但是在很多食品腐敗菌的基因組中同樣存在著編碼DGC和PDE活性蛋白的基因序列，這意味著食品腐敗菌的相關(guān)生理特性也可能受c-di-GMP通路調(diào)控，甚至QS與c-di-GMP通路形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同決定腐敗菌的致腐能力及生物被膜形成。了解食物生態(tài)系統(tǒng)中的QS和c-di-GMP通路以及兩個信號通路之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于進行關(guān)鍵基因的靶向控制，即充分利用現(xiàn)有技術(shù)不斷發(fā)現(xiàn)或合成QS及c-di-GMP調(diào)控劑，從而高效特異地抑制目標(biāo)食源性細菌的致腐和致病能力，解決食物品質(zhì)與安全問題。