卞藝斐,胡士玲,劉 萍,范 開,王帥玉,劉鐘杰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193）

馬齒莧（Portulaca oleracea.L.）又名馬齒菜、螞蟻菜、長(zhǎng)壽菜、五行草等,系馬齒莧科馬齒莧屬植物,是一種藥食同源植物,首載于《新修本草》?！侗静菥V目》記載:“其葉并比如馬齒,而性滑利似莧,故名”。馬齒莧性寒、味酸、無(wú)毒,入心、肝、脾、大腸經(jīng),具有清熱解毒、散血消腫、涼血止血、止痢、止消渴等功效,可用于治療熱痢膿血、熱淋、帶下、便血、瘡瘍腫毒、濕疹等多種疾病[1]。

炎性腸?。↖BD）,包括克羅恩?。–D）和潰瘍性結(jié)腸炎（UC）,是一種慢性、免疫性腸病,以長(zhǎng)期性腹瀉、血便、反復(fù)性發(fā)作為主要臨床癥狀[2]。DSS因帶有負(fù)電荷的硫酸基而對(duì)上皮細(xì)胞有一定毒性,誘導(dǎo)其糜爛而損害結(jié)腸屏障完整性和增加結(jié)腸上皮滲透性,破壞腸黏膜屏障,導(dǎo)致腸道細(xì)菌入侵,引起炎癥反應(yīng)。DSS誘導(dǎo)性結(jié)腸炎發(fā)病部位主要在結(jié)腸遠(yuǎn)端,其病理表現(xiàn)符合潰瘍性結(jié)腸炎的特點(diǎn),是較理想的研究模型[3]。

由于日糧配比不合理、過(guò)量食用高油高熱量食物、運(yùn)動(dòng)量不足等原因,寵物臨床上炎性腸病的發(fā)病率日益升高,嚴(yán)重影響寵物及寵物主人的生活質(zhì)量。目前的治療方法多依賴于免疫抑制類藥物,如糖皮質(zhì)激素及5-羥基水楊酸（5-ASA）,這些治療方法存在副作用明顯、治愈率低等問(wèn)題[4]。迫切需要尋找高效、副作用小的抗炎藥物治療炎性腸病。馬齒莧常用于治療熱毒血痢,療效顯著,本次試驗(yàn)旨在驗(yàn)證馬齒莧水提液對(duì)試驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用,并探究其機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重180 g±7 g的雌性 SD大鼠30只,購(gòu)自北京軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 馬齒莧:購(gòu)自北京同仁堂馬連洼分店,低分子量硫酸葡聚糖鈉（DSS）:美國(guó) Sigma公司;MPO試劑盒:北京華佰泰生物科技公司;TNF-α、IL-1 ELISA試劑盒:美國(guó)R&D公司。

1.3 主要儀器 scout SE602F便攜式電子天平:美國(guó)OHAUS公司;陶瓷全自動(dòng)保健壺CK-30C:佛山市飛鹿電器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-64A:上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵:上海亞榮生化儀器廠。

2 方法

2.1 馬齒莧水提液制備 電子天平稱取100 g馬齒莧,加入1 L蒸餾水,充分浸泡30 min后,先大火煮沸,再調(diào)至小火,30 min后?；?室溫冷卻后將藥液用16層脫脂細(xì)紗布過(guò)濾至大燒杯中,然后用雙層分析濾紙加壓過(guò)濾,最后收集藥液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原藥生藥濃度為1 g/mL。

2.2 動(dòng)物分組與給藥 將30只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、DSS模型組、高濃度藥物組、中濃度藥物組、低濃度藥物組5組,每組6只?？瞻讓?duì)照組:大鼠自由飲用蒸餾水,每日蒸餾水灌胃。模型組:大鼠自由飲用5%DSS溶液,每日蒸餾水灌胃。高劑量藥物組:大鼠自由飲用5%DSS溶液,每日給予10 g/kg·bw馬齒莧。中劑量藥物組:大鼠自由飲用5%DSS溶液,每日給予7.5 g/kg·bw馬齒莧。低劑量藥物組:大鼠自由飲用5%DSS溶液,每日給予5 g/kg·bw馬齒莧。

2.3指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1大鼠結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)（the disease activity index,DAI）評(píng)分 參考文獻(xiàn)方法[5]進(jìn)行DAI評(píng)分。DAI由體重減失率分?jǐn)?shù)、大便狀態(tài)和大便隱血分?jǐn)?shù)相加而得。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):體重減失評(píng)分:體重?zé)o減輕,0分;減輕1% ～5%,1分;減輕5% ～10%,2分;減輕10% ～15%,3分;減輕15%以上,4分。大便狀態(tài)評(píng)分:正常顆粒狀,0分;稍松軟,1分;中度松軟,2分;不成形,3分;水樣糞便,4分。糞便隱血評(píng)分:隱血陰性,0分;隱血弱陽(yáng)性,1分;隱血陽(yáng)性,2分;隱血強(qiáng)陽(yáng)性,3分;肉眼可見(jiàn)血便,4分。

2.3.2 結(jié)腸組織長(zhǎng)/重比 各組大鼠處死后,取大鼠整段結(jié)腸。生理鹽水洗凈腸內(nèi)容物后,吸水紙吸取表面液體,稱重并測(cè)量長(zhǎng)度。

2.3.3 髓過(guò)氧化物（MPO）測(cè)定 取近段結(jié)腸1 cm,迅速放入液氮中冷凍保存。測(cè)定時(shí)加入9倍于組織重量的PBS制成10%組織勻漿,按照MPO試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.3.4 組織炎性因子測(cè)定 組織勻漿制備方法同2.3.3,TNF-α和IL-1濃度分別按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 造模后各組動(dòng)物一般情況 給予DSS飲用3 d,造模組、高、中、低藥物組動(dòng)物均出現(xiàn)稀便、精神沉郁、豎毛等情況。至DSS飲用第5天,造模組大鼠出現(xiàn)血便,體重明顯減輕,而各藥物組與造模組相比狀態(tài)有明顯改善,精神狀態(tài)較好,活動(dòng)靈活。高、中濃度藥物組糞便狀態(tài)與空白對(duì)照組相似。

3.2 大鼠DAI評(píng)分 如圖1所示,造模組均出現(xiàn)比較嚴(yán)重的體重減輕、水樣腹瀉甚至血便,DAI評(píng)分較空白對(duì)照組顯著升高;飼喂高、中、低劑量馬齒莧組均能顯著改善大鼠的癥狀,DAI均顯著降低。

3.3 大鼠結(jié)腸組織腸長(zhǎng)/腸重 如圖2所示,造模組腸長(zhǎng)/腸重比值與空白對(duì)照組相比顯著降低,高劑量、中劑量馬齒莧組的腸長(zhǎng)/腸重比與造模組相比有較顯著升高,低劑量馬齒莧組與造模組相比沒(méi)有顯著差異。

3.4 大鼠結(jié)腸組織MPO活性 DSS造模組結(jié)腸組織中MPO活性較正常組顯著增加,不同濃度馬齒莧水提液均能顯著抑制結(jié)腸組織MPO活性,中劑量組效果更好。

圖1 不同濃度馬齒莧對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠DAI

圖2 不同濃度馬齒莧對(duì)DSS誘導(dǎo)的的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織腸長(zhǎng)/腸重

圖3 不同濃度馬齒莧對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠DAI

3.5 大鼠結(jié)腸組織炎性因子 DSS造模組結(jié)腸組織中TNF-α和IL-1的表達(dá)顯著增高,不同濃度馬齒莧水提液均能顯著抑制結(jié)腸組織TNF-α和IL-1分泌。

4 討論

炎性腸病為腸黏膜免疫保護(hù)效應(yīng)和調(diào)節(jié)效應(yīng)失衡所導(dǎo)致的腸黏膜性疾病。中獸醫(yī)上認(rèn)為炎癥性腸病發(fā)生的關(guān)鍵是濕熱內(nèi)蘊(yùn),氣血壅滯。目前常用的化學(xué)誘導(dǎo)動(dòng)物模型主要有TNBS和DSS誘導(dǎo)的試驗(yàn)性腸炎。本試驗(yàn)中造模組明顯出現(xiàn)體重減輕、腹瀉、便血的癥狀,說(shuō)明DSS造模成功。在試驗(yàn)第3天,藥物治療組與造模組大鼠均出現(xiàn)明顯的腹瀉反應(yīng),DSS飼喂第5天時(shí),造模組大鼠狀態(tài)持續(xù)惡化,治療組出現(xiàn)好轉(zhuǎn),而到DSS飼喂第7天,造模組大鼠出現(xiàn)血便、精神萎靡、體重嚴(yán)重減輕等癥狀,藥物治療組各方面均明顯好于造模組,DAI指數(shù)顯著降低。MPO是嗜中性粒細(xì)胞的特征性酶,組織中的MPO活性代表了嗜中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度,與炎癥密切相關(guān)[6]。DSS造模組結(jié)腸組織中MPO顯著增強(qiáng),而不同濃度藥物組均顯著抑制MPO活性。結(jié)腸組織腸長(zhǎng)/腸重比值減小也是結(jié)腸炎炎性浸潤(rùn)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[7]。DSS造模組大鼠腸長(zhǎng)/腸重比值與空白對(duì)照組相比較顯著降低,而高劑量、中劑量馬齒莧組均有顯著升高。說(shuō)明馬齒莧水提液可以顯著抑制結(jié)腸組織的炎性反應(yīng)。TNF-α是最主要的內(nèi)源性促炎介質(zhì);IL-1介導(dǎo)局部和全身的炎癥反應(yīng),TNF-α和IL-1在炎性腸病進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用,抑制TNF-α和IL-1的表達(dá)是治療炎性腸病的一個(gè)重要方面[8]。本試驗(yàn)中,造模組腸組織勻漿中TNF-α和IL-1濃度均顯著增高5倍以上,馬齒莧治療組的TNF-α和IL-1濃度均有明顯降低,說(shuō)明馬齒莧水提液具有抑制試驗(yàn)性結(jié)腸炎炎性因子分泌的功效。綜上,馬齒莧水提液抑制結(jié)腸炎性因子分泌和組織炎性反應(yīng),對(duì)DSS誘導(dǎo)的試驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠有明顯的保護(hù)作用。

圖4 不同濃度馬齒莧對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織炎性因子濃度

馬齒莧性味酸寒,臨床上多用于治療熱毒血痢。體外抗菌試驗(yàn)表明,馬齒莧醇提物對(duì)多種細(xì)菌、真菌有很強(qiáng)的抗菌能力,被譽(yù)為“天然抗生素”[9]。馬齒莧水提液能有效抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌[10]。馬齒莧對(duì)病毒誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷也有良好的保護(hù)作用[11]。馬齒莧含有豐富的有機(jī)酸類、黃酮類、萜類及生物堿類物質(zhì),其中有機(jī)酸中含量最多的ω-3脂肪酸和黃酮類含量最多的槲皮素、山奈酚均被證明有良好的抗炎作用[12]。馬齒莧抗炎的有效成分及分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究。