楊 新,雷衛(wèi)強(qiáng),邸文達(dá),王春群,周彩顯,張宗澤,方 瑞,周艷琴,趙俊龍,胡 敏

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是一種重要的小反芻動物寄生線蟲,呈世界性分布,致病性強(qiáng)。該線蟲可以感染多種反芻動物,尤其是綿羊和山羊,主要寄生于動物的真胃內(nèi),引起血矛線蟲病導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。由于沒有疫苗可用,捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的防控主要依賴于化學(xué)藥物的使用,常用的化學(xué)藥物包括苯并咪唑類、大環(huán)內(nèi)酯類及煙堿激動劑類[2]。由于長期以及不合理的使用這些化學(xué)藥物,近些年,國內(nèi)外關(guān)于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗藥性的報道越來越普遍[3-5]。苯并咪唑類藥物是使用時間最長的一類藥物,其抗藥性的產(chǎn)生是由捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 I型β微管蛋白編碼基因的3個單核苷酸多態(tài)性（SNP）造成的,分別是167位點(diǎn)由苯丙氨酸變?yōu)榻j(luò)氨酸（TT CTAC）[6],198位點(diǎn)由谷氨酸變?yōu)楸彼?（GAAGCA）[7],200位點(diǎn)由苯丙氨酸變?yōu)榻j(luò)氨酸（TTCTAC）[8]。2017年7月,新疆伊犁地區(qū)某羊場疑似暴發(fā)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病,短時間造成數(shù)頭綿羊的死亡,通過剖檢,在死亡羊的真胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量紅色頭發(fā)絲狀的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲。為了解該羊場捻轉(zhuǎn)血矛線蟲苯并咪唑類藥物抗藥性情況,以便于后續(xù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的有效防控,故在該場開展了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種群I型β微管蛋白基因苯并咪唑抗藥性相關(guān)單核苷酸多態(tài)性的調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 從新疆伊犁地區(qū)某羊場死亡的綿羊真胃中采集了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲樣品,用生理鹽水充分清洗后,雌雄分開保存于70%酒精中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計 參照Bott[9]和von Samson-Himmelstjerna[10]的方法,分別合成針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔（ITS-2）序列和I型β微管蛋白（β-tubulin）編碼基因序列的特異性引物（表1）,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,擴(kuò)增片段分別為 265 bp（ITS-2）和385 bp（β-tubulin）。

1.3 主要試劑及儀器 乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）,及三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）,購自上海國藥集團(tuán);蛋白酶K,購自賽默飛世爾科技有限公司;Wizard?DNA Clean-Up System基因組DNA純化試劑盒,購自Promega公司;10X PCR Buffer、dNTP、rTaq DNA 聚合酶等 PCR擴(kuò)增用試劑,購自寶生物工程（大連）有限公司;Trans 2K Plus I DNA Marker、10 × DNA Loading Buffer,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖、溴化乙錠,購自Sigma-Aldrich公司;PCR儀,購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.4 基因組DNA的提取 按照Gasser的方法分別提取了27條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲的基因組DNA[11],然后使用Wizard DNA Clean-Up System對提取的基因組DNA進(jìn)行純化。

1.5 蟲體ITS-2序列的PCR擴(kuò)增鑒定 反應(yīng)體系:10X PCR Buffer 2.5 μL,dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL,上游引物（ITS-2-F;10 mmol/L）1.0 μL,下游引物（ITS-2-R;10 mmol/L）1.0 μL,Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL,基因組 DNA 2.0 μL,加 ddH2O 至 25 μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min,然后94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共35個循環(huán),最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后,經(jīng)紫外透射儀觀察結(jié)果。

1.6 I型β微管蛋白基因的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系:10X PCR Buffer 2.5 μL,dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL,上游引物（β-tubulin-F;10 mmol/L）1.0 μL,下游引物（β-tubulin-R;10 mmol/L）1.0 μL,Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL,基因組 DNA 2.0 μL,加 ddH2O 至25 μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min,然后94℃變性40 s、53℃退火40 s、68℃延伸40 s,共40個循環(huán),最后68℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后,經(jīng)紫外透射儀觀察結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)分析 將27條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲的I型β微管蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序,測序后對序列信息進(jìn)行分析,統(tǒng)計該捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種群苯并咪唑類藥物抗藥性相關(guān)單核苷酸多態(tài)性情況。

2 結(jié)果

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2序列PCR擴(kuò)增鑒定 使用捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ITS-2種特異性引物對提取的27條雄蟲樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過電泳鑒定,均出現(xiàn)大小為265 bp的特異性目的條帶,說明這27條雄蟲樣品均為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（見圖1）,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 ITS-2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲I型β微管蛋白基因的PCR擴(kuò)增 使用捻轉(zhuǎn)血矛線蟲I型β微管蛋白基因特異性引物對27條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,通過電泳鑒定,均出現(xiàn)大小為385 bp的特異性目的條帶（見圖2）,說明成功擴(kuò)增到I型β微管蛋白基因。對這27條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲I型β微管蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,用于后續(xù)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析。

圖2 I型β微管蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲苯并咪唑類抗藥性相關(guān)SNP的檢測 對27條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲樣品I型β微管蛋白基因序列的3個苯并咪唑類藥物抗藥性相關(guān)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)這27條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲在167位點(diǎn)均為純合敏感型,沒有抗藥型存在;在198位點(diǎn),22條蟲體（81.48%）為純合敏感型,3條蟲體（11.11%）為雜合抗藥型,2條蟲體（7.41%）為純合抗藥型;在200位點(diǎn),25條蟲體（92.59%）為純合敏感型,2條蟲體（7.41%）為雜合抗藥型（見表2）。在這27條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲樣品I型β微管蛋白基因序列中共發(fā)現(xiàn)4種基因型（見中插彩版圖3）,分別是198純合敏感型及200位點(diǎn)純合敏感型（20;74.07%）、198雜合抗藥型及200位點(diǎn)純合敏感型（3;11.11%）、198純合敏感型及200位點(diǎn)雜合抗藥型（2;7.41%）和198純合抗藥型及200位點(diǎn)純合敏感型（2;7.41%）（見表3）。

表2 新疆伊犁地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種群I型β微管蛋白167,198位點(diǎn)和200位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性

表3 新疆伊犁地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種群I型β微管蛋白的基因型及其頻率

3 分析與討論

本試驗(yàn)首次調(diào)查了新疆伊犁地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種群苯并咪唑類藥物抗藥性相關(guān)基因I型β微管蛋白基因序列的3個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（F167Y,E198A和F200Y）。結(jié)果表明,僅在198位點(diǎn)和200位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),抗藥性突變,且198位點(diǎn)抗藥性突變的頻率比200位點(diǎn)要高,沒有在167位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)抗藥性突變,這與我國黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、陜西、云南、廣西及湖北地區(qū)調(diào)查的結(jié)果一致[12],但在其他國家發(fā)現(xiàn)了167位點(diǎn)的抗藥性突變[13]。之前,薄新文等通過多重PCR檢測了我國不同地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲I型β微管蛋白基因200位點(diǎn)的突變情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),新疆地區(qū)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲表現(xiàn)為敏感型,未發(fā)現(xiàn)抗藥型,而本文研究發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)純合抗藥型突變[14]。Barrere等報道,若一個種群中,有超過10%的個體攜帶抗藥基因型（包括一個位點(diǎn)出現(xiàn)純合抗藥型突變和兩個位點(diǎn)同時出現(xiàn)雜合抗藥型突變）,則認(rèn)為這個種群存在抗藥性,不過該學(xué)者在調(diào)查過程中只發(fā)現(xiàn)167位點(diǎn)和200位點(diǎn)的抗藥型突變,并沒有198位點(diǎn)的抗藥型突變[15]。本研究中,新疆伊犁地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種群198位點(diǎn)和200位點(diǎn)的抗藥基因型頻率為7.4%,雖然沒有超過10%,但是存在198位點(diǎn)的純合抗藥基因型,說明該地區(qū)還是存在苯并咪唑抗藥性的風(fēng)險,需要引起我們的警惕,后續(xù)需要采取措施來進(jìn)行控制。

除了分子生物學(xué)的方法,糞便蟲卵計數(shù)減少實(shí)驗(yàn)（FECRT）和蟲卵孵化實(shí)驗(yàn)（EHA）也被用在我國苯并咪唑類藥物抗藥性的調(diào)查。到目前為止,我國的部分省份開展了苯并咪唑類藥物抗藥性的調(diào)查,從調(diào)查的結(jié)果來看,我國江蘇、黑龍江、上海、寧夏、新疆等省份苯并咪唑類藥物抗藥性還是普遍存在的[4-5,16-19]。苯并咪唑類藥物在我國已經(jīng)使用了數(shù)十年,據(jù)報道,一種新藥物一般使用10年左右就可能產(chǎn)生抗藥性[20],未來,我們需要在更多的省份和地區(qū)開展苯并咪唑類藥物抗藥性的調(diào)查,全面的了解我國苯并咪唑類藥物抗藥性現(xiàn)狀,以便及時采取措施進(jìn)行控制。

在山羊和綿羊養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展的今天,寄生蟲病仍然是制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素,由于長期使用化學(xué)藥物來進(jìn)行寄生蟲病的防控,抗藥性問題越來越普遍和嚴(yán)重。本研究首次報道了新疆伊犁地區(qū)綿羊體內(nèi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種群苯并咪唑類藥物抗藥型基因突變的存在,需要引起該場及周邊養(yǎng)殖戶們的重視,采取相關(guān)飼養(yǎng)管理措施來減緩抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展,避免造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。