樊瓊

摘要：新城疫是養(yǎng)禽生產(chǎn)中的常見病、多發(fā)病，對雞群的影響比較大，傳統(tǒng)上我們一般通過臨床表現(xiàn)和剖檢變化對其做出診斷，近年來隨著科技的不斷發(fā)展，實時熒光定量PCR技術也為大家所熟知和掌握，本文就一例采用實時熒光定量PCR技術診斷新城疫的過程進行介紹。

關鍵詞：新城疫；PCR；診斷

新城疫（ND）又稱亞洲雞瘟，主要侵害雞、火雞、野禽及觀賞鳥類，由雞新城疫病毒（NDV）引起，死亡率高，對養(yǎng)雞業(yè)危害嚴重。近日在錦州某一蛋雞規(guī)模場，50日齡的雞群突然出現(xiàn)呼吸困難，采食量下降，個別出現(xiàn)運動失調等臨床癥狀。對其中3只死亡雞只進行了剖檢，發(fā)現(xiàn)眼結膜出血；脾臟萎縮，是正常脾的1/2大??；卵泡變形、出血、菜花樣變；腺胃乳頭靠近腺胃肌胃相接處出血，腸道濾泡腫脹，腸道黏膜有密集出血斑；盲腸扁桃體萎縮出血；泄殖腔有輕度出血。采集3只病死雞的組織病料，對同群未發(fā)病的2只雞采集了喉、肛拭子，用于新城疫病原學檢測。

1材料與方法

1.1病料

無菌采集新鮮臟器（喉頭、氣管、心、肝、脾、肺、腎、小腸）各2g并加入5mL PBS（磷酸緩沖溶液）于研磨器中充分研磨，離心取上清液轉入無菌離心管中保存?zhèn)溆?。喉、肛拭子可以直接用于實驗?/p>

1.2主要儀器

Ⅱ級生物安全柜（1300系列A2型，Thermo Scientific）；熒光定量PCR儀（105，美國伯樂）；臺式冷凍高速離心機（Sorvall Stratos，Thermo）。

1.3實驗方法

按照離心柱式提取法提取核酸，嚴格按照凱杰生物工程（深圳）有限公司新城疫病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒的說明書進行操作。加入制備的RNA溶液10uL，反應體系25uL。

2結果

具體結果見圖1。從圖1中可以看出，病死雞的3份樣品均為陽性，2份健康雞全為陰性。說明病死雞患有新城疫。

3小結

3.1實時熒光定量PCR技術的應用現(xiàn)狀

隨著動物疫病檢測技術的不斷發(fā)展，原有的檢測手段已不能滿足現(xiàn)代疫病診斷的需要，PCR技術也漸漸脫掉了那層“神秘的面紗”，尤其是近幾年來基層獸醫(yī)隊伍不斷地發(fā)展、壯大，從業(yè)人員業(yè)務素質也在逐年提高，原來的“高精尖”的診斷技術逐步走進了日常的檢測工作中。PCR技術具有高度的靈敏性、特異性和精確性，而且快速、高效、靈活、易于操作，尤其是實時熒光定量PCR技術與常規(guī)PCR相比具有特異性更強、自動化程度更高等優(yōu)點，目前已得到廣泛應用。

3.2實時熒光定量PCR的結果判定

參照凱杰生物工程（深圳）有限公司新城疫病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒的說明書對檢測結果進行判定。

3.2.1質控標準陰性對照CT值應等于none；陽性對照CT值應小于等于28.0。

3.2_2結果判斷讀取數(shù)據(jù)時基準線調至與陰性對照重合，陰性CT值為none，陽性CT值為16.89，實驗結果有效。圖1中3、4、5樣本對應的CT值分別為17.62、18.53、19.17，判定為陽性；7、8樣本對應的CT值均為none，判定為陰性。