舒 若，田 衍，曾玉劍，羅華友，李 穎

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸與疝外科，昆明 650032)

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年約有600 000例患者死于結腸癌[1-2]。盡管在診斷和治療上取得重大進展，但結腸癌的病死率仍然很高[3]。轉移是惡性腫瘤的主要生物學行為，也是影響治療效果和預后的主要原因之一[4-5]。許多研究表明，microRNA在癌癥進展和轉移中發(fā)揮重要作用[6-7]。microRNA是一類片段小的非編碼RNA，能夠通過抑制翻譯而減少特定靶基因的表達[8-10]。其中相關研究報道MicroRNA-29b (miR-29b)在結腸癌中低表達，并在癌癥轉移中發(fā)揮重要作用[11-12]。同時發(fā)現(xiàn)T淋巴瘤浸潤轉移誘導因子1(T lymphoma invasion and metastasis including factor 1,Tiam1)是一個鳥嘌呤核苷酸交換因子，能夠選擇性地激活類似Rho GTP酶[13]，在結腸癌中高表達，并且在癌癥轉移中起著至關重要的作用[14-15]。生物信息學和分子生物學實驗表明miR-29b可與Tiam1 mRNA的3′-UTR結合，直接抑制癌細胞中Tiam1的轉錄后表達，提示miR-29b可能Tiam1的直接靶基因[16]。但目前綜合分析miR-29b和Tiam1在結腸癌的表達及其意義鮮有報道。本研究通過檢測結腸癌組織和癌旁組織中miR-29b、Tiam1 mRNA表達，分析二者相關性，并且觀察它們與結腸癌病理特征的關系，以探討結腸癌的發(fā)病機制和發(fā)現(xiàn)潛在的藥物治療靶點。

表1 基因引物序列

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2015年6月至2017年3月手術切除的結腸癌組織標本及癌旁正常組織(距離癌組織大于5 cm)，手術切除的新鮮標本置于-80 ℃冰箱保存。標本共計30例，其中男16例，女14例；年齡42～80歲，平均(66.87±8.13)歲。參考全國結直腸癌協(xié)作組結直腸癌診治規(guī)范及AJCC/UICC的TNM分期標準對結腸癌組織進行診斷和分期(Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅱ～Ⅳ期12例)[17]。所有受試者均已簽署知情同意書，本研究通過本院倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR法檢測miR-29b、Tiam1 mRNA表達水平 提取總RNA:按照Trizol試劑說明書取約50 mg組織提取總RNA，RNase-Free H2O溶解RNA，微量分光光度計檢測RNA濃度及純度，然后反轉錄合成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肨aqman RT-PCR kit進行PCR擴增，檢測miR-29b以U6為內(nèi)參基因，檢測Tiam1 mRNA表達水平以GAPDH為內(nèi)參基因。反應體系在ABIQ6型實時熒光定量PCR儀上進行，測定每個樣品的Ct值?；虻谋磉_以相對含量=2-△△Ct的形式呈現(xiàn)?；蛞镄蛄幸姳?。

1.2.2蛋白免疫印跡檢測Tiam1的表達 分別取約250 mgⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的結腸癌組織加入RIPA lysis buffer提取總蛋白。然后將各樣品放入4 ℃離心機中12 000 g離心15 min，收集上清液。利用BCA protein assay kit確定蛋白濃度。為了檢測Tiam1在不同分期結腸癌組織中的表達，各取80 μg的蛋白在15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，75 V下反應2 h，然后轉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。向PVDF膜加入Tiam1一抗(Abcam)在4 ℃過夜孵育后，再加入二抗孵育2 h，最后加入電化學發(fā)光(ECL)發(fā)光液在Alpha Innotech曝光成像分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參蛋白。

1.2.3觀察指標 記錄并統(tǒng)計所有參與者臨床分期和是否出現(xiàn)淋巴結轉移。

2 結 果

2.1miR-29b與Tiam1 mRNA的表達 miR-29b在結腸癌組織(0.50±0.27)比其在癌旁組織(1.00±0.00)中的表達低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Tiam1 mRNA在結腸癌組織(4.22±2.13)比其在癌旁組織(1.00±0.00)中的表達高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2miR-29b與Tiam1 mRNA的相關性分析 將miR-29b與Tiam1 mRNA在結腸癌組織與癌旁組織中的表達進行相關性分析，結果顯示二者表達呈顯著負相關(r=-0.869，P<0.01)，見圖1。

圖1 miR-29b與Tiam1 mRNA表達的相關性

2.3miR-29b、Tiam1 mRNA表達與結腸癌主要臨床病理特征的關系 在不同臨床分期中，miR-29b和Tiam1 mRNA的表達水平表現(xiàn)出不同的趨勢。隨著臨床分期的進展，miR-29b表達呈下降的趨勢，其中Ⅲ期、Ⅳ期結腸癌組織中miR-29b的相對表達量為0.23±0.08，明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期結腸癌(0.69±0.18，P<0.05)。隨著臨床分期的進展，Tiam1 mRNA表達呈上升的趨勢，其中Ⅲ期、Ⅳ期結腸癌組織中Tiam1 mRNA的相對表達量為6.10±1.86，明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期結腸癌(2.97±1.15，P<0.05)。并且利用蛋白免疫印跡檢測Tiam1在不同分期結腸癌組織中的蛋白表達也顯示Ⅲ期、Ⅳ期結腸癌組織中Tiam1蛋白的相對表達量明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期結腸癌組織中的表達(圖2)。另外，miR-29b和Tiam1 mRNA表達還顯示出與淋巴結轉移的密切聯(lián)系，miR-29b在有淋巴結轉移結腸癌組織的表達明顯低于無淋巴結轉移者(P<0.05)，而有淋巴結轉移結腸癌組織中Tiam1 mRNA表達水平明顯高于無淋巴結轉移者(P<0.05)，見表2。

圖2 Tiam1蛋白在不同分期結腸癌組織中的表達

表2 miR-29b、Tiam1 mRNA表達水平與結腸癌臨床病理特征的關系

3 討 論

結腸癌的發(fā)生是一個多因素、多階段和多基因改變協(xié)同作用的過程，其發(fā)生的分子基礎包括癌基因和抑癌基因的表達失調(diào)[18]。研究結腸癌的發(fā)病機制，如分子遺傳學和生物學的改變，在將來有希望能夠改善患者的預后。但是，不幸的是，大多數(shù)患者死于其轉移性[19]。因此，研究結腸癌的發(fā)生和轉移都尤為重要。

最近幾年，許多研究表明microRNAs通過綁定不同的mRNAs在腫瘤發(fā)生和轉移中發(fā)揮重要作用[20]。到目前為止，在結腸癌中已有許多異常表達的microRNAs，如miR-21、miR-124和miR-29b等，并且這些microRNAs在結腸癌的發(fā)生和進程中起著至關重要的作用[21-23]。本研究對30例結腸癌組織和癌旁正常組織研究發(fā)現(xiàn)，結腸癌組織中miR-29b表達下降，同時Tiam1過表達，二者呈顯著負相關。結合相關文獻報道及生物信息學分析，推測腸道正常組織miR-29b對Tiam1的表達呈負向調(diào)控。在各種致瘤因子的刺激下，miR-29b對Tiam1的負向調(diào)控相對較弱，從而使Tiam1的表達在病理狀態(tài)下增加，影響腫瘤的微環(huán)境，從而進一步誘導和促進腫瘤細胞的轉移。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，Tiam1在結腸癌組織中的表達升高，并且TNM分期Ⅰ和Ⅱ期結腸癌組織中miR-29b的表達水平明顯高于Ⅲ和Ⅳ期結腸癌(P<0.05)，而TNM分期Ⅰ～Ⅳ期結腸癌組織中Tiam1表達有上升趨勢，即Ⅰ和Ⅱ期結腸癌組織中Tiam1 mRNA的表達水平明顯低于Ⅲ和Ⅳ期結腸癌(P<0.05)。該結果說明miR-29b和Tiam1可能成為結腸癌臨床分期的指標。另外，miR-29b在有淋巴結轉移結腸癌組織的表達明顯低于無淋巴結轉移者，Tiam1 mRNA表達與其相反。LIU等[14]研究發(fā)現(xiàn)Tiam1在轉移性結腸癌細胞系(LoVo和SW620)中的表達明顯高于原發(fā)性結腸癌細胞系(LS174T,SW480，HCT116，LST，HRT和Hee8693)的表達，這說明Tiam1基因與轉移性結腸癌密切相關。WANG等[16]還發(fā)現(xiàn)miR-29b能夠通過下調(diào)Tiam1和抑制上皮間質(zhì)轉分化從而抑制結腸癌細胞的生長和轉移。

本文結果提示結腸癌中miR-29b表達下降并且伴隨Tiam1表達上調(diào)可能是結腸癌的發(fā)病機制之一，miR-29b和Tiam1可以成為結腸癌潛在的診斷標志物。