陳煒瑋，林新富，楊 笑，黃昉萌，駱杰偉，吳永希，魏世超，鄭星宇＊＊

（1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院中醫(yī)科 福州 350001；3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系外科護(hù)理學(xué)教研室 福州 350101；4.福建省立醫(yī)院兒科 福州 350001）

2007 年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）為了揭示微生物與人體疾病之間的聯(lián)系，啟動(dòng)了人類(lèi)微生物組計(jì)劃（Human Microbiome Project，HMP）[1-2]。NIH牙顱頜面研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research，NIDCR）在2008年啟動(dòng)了人體口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Oral Microbiome Catabase，HOMD）計(jì)劃[3]。HOMD的主要目標(biāo)是提供數(shù)百種人體口腔原核生物物種群落的全面信息。2015年再次啟動(dòng)了“全民個(gè)體微生物組檢測(cè)項(xiàng)目”，旨在以口腔、皮膚及腸道微生物群落為主要研究靶點(diǎn)，將“人類(lèi)微生物組計(jì)劃”的研究結(jié)果進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化，從“第二基因組”中尋找更加精準(zhǔn)的疾病預(yù)警分子標(biāo)記。而因胃氣的強(qiáng)弱不同、感受邪氣的寒熱不同，形成了多樣的病理性舌苔[4]。本研究收集冠心病患者與健康對(duì)照者的舌苔標(biāo)本，進(jìn)行舌苔菌群16S rDNA的V4區(qū)域的高通量測(cè)序[5,6]，將現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)辨證相結(jié)合，探索不同中醫(yī)證型菌群的奧秘之處。

1 材料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照1979年WHO制定的《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]、2014年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟病學(xué)院《非ST段抬高型急性冠脈綜合征診治指南》、2015年《中國(guó)急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》，包括：穩(wěn)定型心絞痛、急性冠脈綜合征（包括不穩(wěn)定型心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死）、陳舊性心肌梗死。舌苔分級(jí)：（1）薄白苔（white thin coating，WTC）：苔色白，苔質(zhì)薄，透過(guò)舌苔能隱隱見(jiàn)到苔質(zhì)，舌苔潤(rùn)澤有津，舌色淡紅，即“淡紅舌，薄白苔”。（2）黃厚苔（yellow thick coating，YTC）：苔色淡黃或黃，苔質(zhì)較厚（即不能透過(guò)舌苔見(jiàn)到舌質(zhì)），或部分舌面見(jiàn)厚苔，僅少部分舌面見(jiàn)薄苔，苔質(zhì)干或不干，舌色淡紅或紅。（3）很黃厚苔（extremely yellow thick coating，EYTC）：苔色黃，苔質(zhì)厚或極厚，全舌面見(jiàn)厚苔，苔質(zhì)干，舌色紅或絳紅。舌象診斷參照《中醫(yī)診斷學(xué)》[8]。每一個(gè)舌像均由固定的2位福建省立醫(yī)院中醫(yī)科副主任及以上醫(yī)師判定，并照相保存。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)福建省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，簽訂知情同意書(shū)。符合穩(wěn)定型心絞痛、急性冠脈綜合征、陳舊性心肌梗死標(biāo)準(zhǔn)患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除3個(gè)月內(nèi)使用抗生素治療者；排除患有糖尿病、血液病、心力衰竭、腎衰等重要疾病者；排除有肝炎、結(jié)核病等傳染性疾病者；排除不能進(jìn)行正常交流及合作者；排除有口腔頜面部腫瘤患者；排除有放、化療史者；排除有長(zhǎng)期飲酒史者；排除有長(zhǎng)期吸煙史者。

1.3 一般資料

共收集2015年12月至2016年3月于福建省立醫(yī)院就診且符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的冠心病患者70例，平均年齡為64.64±7.27歲，其中男性40例，女性30例，薄白苔15例（男11例，女4例），黃厚苔33例（男17例，女16例），很黃厚苔22例（男12例，女10例）。收集同期來(lái)自福建省立醫(yī)院體檢中心的體檢人群中健康人組28例作為對(duì)照，健康對(duì)照組平均年齡為64.13±5.23歲，其中男性15例，女性13例，薄白苔28例。組間年齡、性別無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

1.4 方法

1.4.1 舌苔樣本取備、DNA提取

舌苔取樣按照HMP手冊(cè)流程（Manual of Procedures for Human Microbiome Project，Version 12.0(Accession:phd003190.2)）。DNA提取嚴(yán)格按照QIAamp? DNA Mini Kit操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用16s rRNA通用引物515F/806R（515F:XXXXXGTGCCAGCMGCCGCGGTAA,806R:XXXXXGGACTACVVGGGTATCTAATC）對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。XXXXX：每組內(nèi)標(biāo)簽序列，用于不同組別、不同樣品的區(qū)分。

1.4.2 16s rRNA基因V4區(qū)測(cè)序

PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化后，文庫(kù)質(zhì)檢合格后，使用Ion Plus Fragment Library Kit進(jìn)行文庫(kù)定量，并根據(jù)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合均一化。用16S特定引物擴(kuò)增特異可變區(qū)V4區(qū)域，得到300bp左右擴(kuò)增片段。采用Ion PGM?System測(cè)序，對(duì)照組28個(gè)樣品采用兩個(gè)Ion 314?C hip K it v2芯片，其余樣品采用一個(gè)Ion 318?Chip Kit v2芯片。

1.4.3 OTU聚類(lèi)

將序列完全一樣的Clean Reads按其豐度大小排序。過(guò)濾掉其中的Singletons（singletons為對(duì)應(yīng)read只有一條的序列，疑因測(cè)序錯(cuò)誤所致，為減少誤差，將這部分序列去除，不進(jìn)入后期OTU聚類(lèi)）。再將所有的序列用vsearch分析軟件去嵌合體，按相似度0.97進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類(lèi)，對(duì)聚類(lèi)后的OTU進(jìn)行篩選，只保留大于兩條的OTU（類(lèi)似與之前的singletons篩選）。將豐度大于2的OTU代表序列用rdp-classifier進(jìn)行物種注釋?zhuān)玫轿锓N豐度表。統(tǒng)計(jì)各樣本中各OTU的豐度信息，將各個(gè)OTU中豐度最高的一條序列挑選出來(lái)，作為該OTU的代表序列。使用RDP方法，將該代表序列與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種歸類(lèi)。

1.4.4 顯著性差異分析

在兩組樣本中采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)檢測(cè)不同組間豐度差異顯著的物種；再用成組的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，對(duì)在上一步中獲得的顯著差異物種進(jìn)行組間差異分析；最后用線(xiàn)性判別分析（LDA）對(duì)數(shù)據(jù)降維和評(píng)估具有顯著差異的物種的影響力，即LDA score（差異菌群判定標(biāo)準(zhǔn)為L(zhǎng)DAscore大于3，P值小于0.01）。用R語(yǔ)言軟件進(jìn)行treeplot構(gòu)建，進(jìn)行舌苔菌群類(lèi)型分析。

2 結(jié)果

2.1 OTU與物種注釋分析

統(tǒng)計(jì)出來(lái)的OTU的豐度初步說(shuō)明了樣品的物種豐富程度。采用cutadapt配合python腳本的方法進(jìn)行拆分，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的測(cè)序條數(shù)，使用卡方檢驗(yàn)分析兩組間reads，冠心病reads中位數(shù)21969.50（17468.75-33261.00）多于對(duì)照組中位數(shù)16753.00（13326.25-24492.25），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z值=-2.253，P=0.024）。本實(shí)驗(yàn)共得到10506個(gè)不同的OTU，找出兩組間有顯著差異的OTU有1068個(gè)（P＜0.05）。物種注釋分析將1068個(gè)差異OTU（P＜0.05）與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)物種注釋結(jié)果，在門(mén)水平得到16個(gè)物種，綱水平得到31個(gè)物種，目水平得到51個(gè)物種，科水平得到86個(gè)物種，屬水平得到160個(gè)物種。本實(shí)驗(yàn)中在屬水平上找出有差異的物種84個(gè)（P＜0.05）。

表1 2組有顯著作用的微生物類(lèi)群（線(xiàn)性回歸分析，LDA）

圖1 LDA effectsize進(jìn)化分支圖

2.2 LDAEffectSize（LEfSe）

分析采用線(xiàn)性判別分析（LDA）來(lái)估算每個(gè)組分（物種）豐度對(duì)差異效果影響的大小，找出對(duì)樣品劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種[9]。本實(shí)驗(yàn)組間有差異物種，見(jiàn)表1。LDA effectsize進(jìn)化分支圖，見(jiàn)圖1。分析可以看出，冠心病優(yōu)勢(shì)菌屬有棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、布克氏菌屬（Burkholderialles）、乳酸菌屬（Lactobacillus）；對(duì)照組優(yōu)勢(shì)菌屬有消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、lachnoanaerobaculum、紅細(xì)菌目（rhodobacterales）、紅桿菌科（rhodobacteraceae）。

圖2 屬水平上的treeplot構(gòu)建

圖3 4組group的冠心病組與對(duì)照組菌群占比分布圖

2.3 舌苔菌群類(lèi)型分析

對(duì)樣品進(jìn)行聚類(lèi)為四大類(lèi)（圖2）。group1的優(yōu)勢(shì)菌屬是鏈球菌屬（Streptococcus），group2的優(yōu)勢(shì)菌屬是普雷沃氏菌屬（Prevotella），group3的優(yōu)勢(shì)菌屬是梭桿菌屬（Fusobacterium），group4的優(yōu)勢(shì)菌屬是奈瑟菌屬（Neisseria）。四種group特點(diǎn)（圖3）。group1中普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬、奈瑟菌屬在CHD組、對(duì)照組占比均分列前三。group2中，CHD組的呈優(yōu)勢(shì)占比的菌屬依次為鏈球菌屬、普雷沃氏菌屬和羅氏菌屬（Rothia）；對(duì)照組為羅氏菌屬、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬。group3中，CHD組占比優(yōu)勢(shì)菌屬分別為普雷沃氏菌屬、奈瑟菌屬、鏈球菌屬；對(duì)照組則為普雷沃氏菌屬、奈瑟菌屬、梭桿菌屬。group4的CHD組占比優(yōu)勢(shì)菌屬依次為奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬；對(duì)照組則為奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬。

表3 各group舌苔情況預(yù)測(cè)

2.4 菌群分型風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)

各組患冠心病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)（表2）。以group1為參照，group2、3、4患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)遞增。而罹患冠心病風(fēng)險(xiǎn)較高的group2，group3，group4又在菌群特征上有明顯不同，提示冠心病可能存在特定的菌群結(jié)構(gòu)。各group舌苔情況預(yù)測(cè)，見(jiàn)表3。以group1為參照，group2、3、4患薄白、黃厚、很黃厚舌苔遞增關(guān)系。

2.5 RDA分析

冗余分析（redundancy analysis,RDA）主要用來(lái)反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，見(jiàn)圖4。group3與hs-CRP、IL-6、IL-8等炎癥指標(biāo)密切相關(guān)。

3 討論

《舌鑒總論》中云：“舌為心之外候，苔為胃之明證，察舌可占正之盛衰，驗(yàn)苔以識(shí)邪之出入”。舌苔是由脾胃之氣上熏，胃津上潮，凝聚于舌面而成。若胃氣夾邪氣上泛于舌，就會(huì)形成病理性舌苔。口腔微生物組與牙周疾病、心血管疾病之間的聯(lián)系一直倍受關(guān)注?？谇痪旱氖Ш鈺?huì)啟動(dòng)或加劇動(dòng)脈硬化過(guò)程[10]。泡沫細(xì)胞形成是動(dòng)脈硬化初始關(guān)鍵步驟，低密度脂蛋白（LDL）與牙齦卟啉菌的特異性蛋白結(jié)合，聚集的LDL可誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞[11]。此外，在動(dòng)脈粥樣斑塊中找到韋榮菌、普雷沃氏菌、牙齦卟啉單胞菌、梭桿菌、華麗單胞菌屬等的報(bào)道[12,13]。斑塊中韋榮球菌屬、鏈球菌屬豐度與在口腔中的豐度相關(guān)，并且細(xì)菌與白細(xì)胞、血漿膽固醇水平相關(guān)[14]。牙齒的獨(dú)特結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)細(xì)菌生物膜的沉積，細(xì)菌生物膜在牙齦邊緣處的過(guò)度積累會(huì)引起炎癥。微生物內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)會(huì)促進(jìn)病原體毒力因子表達(dá)，如牙齦卟啉單胞菌可致齲齒或牙周炎等發(fā)生或加劇[15]。齲病、牙周病等常見(jiàn)口腔疾病患病率的升高，增加了人群罹患動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等的風(fēng)險(xiǎn)[16,17]。Mattila等研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者的牙周健康狀況明顯差于健康組，多存在慢性牙周炎、齲壞、慢性根尖周炎、冠周炎等[18]。一項(xiàng)有關(guān)CHD與牙周炎相關(guān)性的Meta分析結(jié)果顯示牙周炎是獨(dú)立于傳統(tǒng)CHD危險(xiǎn)因素的一種危險(xiǎn)標(biāo)記，相對(duì)危險(xiǎn)度為1.24-1.35[19]。

牙周致病菌多為能產(chǎn)生脂多糖（LPS）的革蘭陰性菌，可導(dǎo)致牙周組織局部炎癥，并形成牙齦的潰瘍和局部血管化[20]。牙齦致病菌可通過(guò)炎癥的牙周組織進(jìn)入血液，刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)各種致炎因子，包括單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)、E選擇素等，引起動(dòng)脈炎癥，參與動(dòng)脈粥樣硬化。此外，粥樣硬化斑塊形成后，牙周致病菌還能通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達(dá)，降低MMP組織抑制物表達(dá)，參與斑塊破裂[21]。血管平滑肌細(xì)胞感染牙齦卟啉單胞菌后，可致組織因子和纖溶酶原激活物等因子失調(diào)，導(dǎo)致高凝、血栓形成[22,23]。牙周致病菌及脂多糖等代謝產(chǎn)物在誘導(dǎo)局部炎癥和組織破壞的同時(shí)，還不斷刺激宿主，產(chǎn)生系統(tǒng)性炎癥與免疫反應(yīng)，導(dǎo)致CRP、TNF-α、IL-113、IL-6等炎性因子上調(diào)[23,24]。另外，與消化道菌群代謝產(chǎn)物氧化三甲胺（TMAO）有關(guān)，TMAO會(huì)抑制血液中膽固醇的降解，進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)group 1、2、3、4的優(yōu)勢(shì)菌屬分別是Streptococcus、 Prevotella、 Fusobacterium、 Neisseria。Streptococcus為革蘭陽(yáng)性菌，為口腔正常定植菌，為健康人及口臭者口腔中的優(yōu)勢(shì)菌群，與口臭等口腔癥狀密切相關(guān)[26]；prevotella是革蘭陰性專(zhuān)性厭氧菌，其可能為牙周疾病的主要可疑致病菌[27]。Neisseria是寄生在人體呼吸道的的條件致病菌屬，與牙菌斑生物膜形成有關(guān)，牙菌斑生物膜過(guò)量沉積會(huì)誘發(fā)牙周炎[28]。此外，梭桿菌、鏈球菌和奈瑟菌豐度與動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)信號(hào)如血漿膽固醇水平相關(guān)。分析發(fā)現(xiàn)group3與hs-CRP、IL-6、IL-8等炎癥指標(biāo)有較顯著的相關(guān)性。Fusobacterium是臨床常見(jiàn)的革蘭陰性無(wú)芽胞厭氧桿菌，主要存在于口腔牙垢中，可致人的嚴(yán)重感染，如菌血癥等[29]。具核梭桿菌（F.nucleatum）存在于牙齦下斑塊中，是慢性牙周炎重要的感知生物體，其可以誘導(dǎo)外周嗜中性粒細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子（IL-1β，TNF-α，IL-8）等的產(chǎn)生，參與慢性牙周炎炎癥反應(yīng)[30]。

本研究通過(guò)OR值分析出舌苔菌群結(jié)構(gòu)與患冠心病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并影響著舌苔變化。有研究認(rèn)為，冠心病舌色、苔色、舌形、舌苔厚度、瘀斑瘀點(diǎn)5類(lèi)觀察值在各中醫(yī)證型有明顯差別[31]。冠心病不同亞型的舌苔也存在著差異性，隱匿型冠心病患者舌苔多為薄白苔，冠心病心絞痛患者舌苔改變以膩苔和少苔或無(wú)苔為主。其中不穩(wěn)定型冠心病心絞痛患者出現(xiàn)膩苔的幾率較穩(wěn)定型心絞痛患者高，且隨著病情的好轉(zhuǎn)，其舌苔逐漸轉(zhuǎn)為正常[32]。而且冠心病患者舌象的動(dòng)態(tài)變化可以反映病情進(jìn)展，預(yù)示冠心病的預(yù)后情況。如急性心肌梗塞時(shí)舌苔有明顯的由薄變厚、再由厚變薄的變化趨勢(shì)[33]?？梢?jiàn)疾病特有的舌苔菌群結(jié)構(gòu)，使其發(fā)揮“疾病預(yù)警”的功能，將會(huì)為疾病防治提供新的靶點(diǎn)和思路。