陳吉祥， 陳金才， 黨勝春， 崔磊， 錢小寶

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

根據(jù)最新流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌死亡率在全球常見腫瘤中排第4位[1]。因診斷困難，難以早期發(fā)現(xiàn)，且惡性程度高，胰腺癌預(yù)后較差，患者5年生存率小于5%[2]。胰腺癌治療的關(guān)鍵在于早期診斷，但因為胰腺系腹膜后器官，早期病灶難以發(fā)現(xiàn)。目前一些臨床常用的腫瘤標志物雖然對胰腺癌的診斷、治療效果監(jiān)測及預(yù)后評估起到了一定作用，但特異性和敏感性較低[3]。

叉頭框(forkhead box，F(xiàn)OX)家族是具有一段高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子超家族，包含至少43個成員[4-7]，叉頭框C2(forkhead box C2，F(xiàn)OXC2)轉(zhuǎn)錄因子是人類forkhead家族的一個重要成員，與血管淋巴管的形成、肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗[8-10]以及2型糖尿病[11]等密切相關(guān)。另外，F(xiàn)OXC2在乳腺癌[12]、婦科惡性腫瘤[13-14]、食管癌[15]、胃癌[16]等多種惡性腫瘤細胞中呈過表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2能夠使癌細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，其與腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[17]。然而，F(xiàn)OXC2在胰腺癌組織中的表達及其對各臨床指標的影響尚不清楚。本研究旨在通過檢測胰腺癌組織中FOXC2的表達，分析其與胰腺癌患者臨床資料的相關(guān)性，了解FOXC2對患者生存時間的影響。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌公共數(shù)據(jù)資料

利用Oncomine數(shù)據(jù)平臺，根據(jù)研究目的設(shè)定篩選條件：(1) Cancer Type：pancreatic cancer；(2) Gene：FOXC2；(3) Data Type：mRNA；(4) Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；(5) Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 主要試劑和材料

FOXC2小鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兔抗小鼠IgG二抗(上海倍卓生物科技有限公司)；山羊血清(鄭州九龍生物制品公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海Fermentas公司)；SYBR Green PCR試劑盒(美國Thermo公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)。

高速低溫冷凍離心機，酶標儀(美國Thermo公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Real-time PCR擴增儀(美國ABI公司)。

1.3 患者信息及標本采集

收集2005年1月至2009年12月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院普外科行胰腺癌根治術(shù)的112例胰腺癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁組織。納入標準：術(shù)前影像學(xué)檢查未見遠處轉(zhuǎn)移；術(shù)后病理學(xué)確診為胰腺導(dǎo)管腺癌；年齡30～85歲；術(shù)前均未接受放化療。其中，男63例，女49例，年齡35～81歲。癌旁組織取距離腫瘤邊緣2 cm以上[18]。以美國癌癥聯(lián)合委員會第八版胰腺癌分期系統(tǒng)作為臨床分期分級標準。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。所有患者隨訪至2013年12月。

1.4 實時定量PCR法檢測FOXC2 mRNA的表達

使用Primer 5.0設(shè)計引物序列。FOXC2：上游引物，5′-AGCTACATCGCGCTCATCAC-3′；下游引物，5′-CGTTCTCGAACATGTTGTAG-3′；GAPDH(內(nèi)參)：上游引物，5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′；下游引物，5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。使用Trizol法從癌組織和匹配的癌旁組織中提取總RNA，將純化后的總RNA溶于40 μL DEPC水中。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA文庫，反應(yīng)體系25 μL，其中RNA引物12 μL，5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液5 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，25 U/μL RNA酶抑制劑1 μL，200 U/μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，Oligo(dt)18 μL，去離子水(不含RNA酶) 4 μL；反應(yīng)程序：37 ℃ 60 min；85 ℃ 4 min；4 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系25 μL，其中SYBRTM熒光預(yù)混液12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，去離子水9.5 μL，cDNA模板2 μL(對照加入等量的去離子水)；反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。采用ABI Prism 7300 SDS 軟件分析數(shù)據(jù)，用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達量。每組實驗重復(fù)3次。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測FOXC2蛋白的表達

取臨床胰腺癌組織和配對癌旁組織蠟塊標本進行連續(xù)切片，厚度為5 μm，吸附于防脫載玻片上。將切片置于溫箱中60 ℃烘烤1 h，二甲苯浸泡2次脫蠟；梯度乙醇水化；抗原高壓熱修復(fù)(0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液，pH=6.0)；封閉內(nèi)源性過氧化物酶(3%H2O2溶液)，室溫下暗室浸泡30 min；室溫下血清封閉(含5 %山羊血清的PBS溶液)30 min；加入FOXC2小鼠單克隆抗體(1 ∶100)，加入等量PBS溶液代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；加入兔抗小鼠IgG(1 ∶500)，37 ℃濕盒中孵育2 h；PBS洗滌3次，每次5 min；DAB顯色10 min，自來水漂洗終止顯色，蘇木精染液復(fù)染胞核。

陽性結(jié)果標準：顯現(xiàn)出邊界清晰，突出于背景的棕黃色或棕褐色顆粒；每張切片100×視野隨機挑選5個視野，根據(jù)每個視野陽性染色細胞比例行陽性細胞率評分(PS)。無，記為0分；1%～33%，記為1分；34%～67%，記為2分；67%～100%，記為3分。染色強度評分(IS)根據(jù)顏色由淺入深來劃分(0=無色；1=淺黃色；2=棕黃色；3=棕褐色)。PS與IS相加可得總分，0～2分判斷為陰性結(jié)果，3～6分判斷為陽性結(jié)果[19-20]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 FOXC2 mRNA在胰腺癌組織中的表達

檢索FOXC2在Oncomine中的數(shù)據(jù)，共納入兩2項研究： (1) Badea Pancreas Statistics；(2) Pei Pancreas Statistics。Badea芯片數(shù)據(jù)中共有78例樣本，包括39例胰腺癌組織及對應(yīng)的癌旁組織。Pei芯片數(shù)據(jù)中共有52例樣本，包括36例胰腺癌組織及16例胰腺組織。分析結(jié)果顯示，Badea和Pei芯片數(shù)據(jù)中胰腺癌組織FOXC2 mRNA表達量明顯高于癌旁組織(t=4.074，3.741，P均<0.05)。見圖1。

A：Badea胰腺癌芯片數(shù)據(jù)；B：Pei 胰腺癌芯片數(shù)據(jù)

2.2 FOXC2在胰腺癌組織中的表達

免疫組化染色結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2蛋白主要表達于胰腺癌細胞胞核(圖2)，且癌組織免疫組化評分明顯高于癌旁組織(t=7.571，P<0.05)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，胰腺癌組織中FOXC2 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織(t=13.79，P<0.05)，見圖3。

2.3 FOXC2表達與患者臨床病例資料的關(guān)系

根據(jù)免疫組化評分結(jié)果，將0～2分列入FOXC2陰性組，將3～6分列入FOXC2陽性組。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，112例胰腺癌癌組織中，有84例表達為陽性(75.0%)；在癌旁組織中有26例FOXC2表達為陽性(23.2%)。FOXC2蛋白在癌組織中陽性表達率高于癌旁組織(χ2=60.1，P<0.001)。FOXC2蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織(χ2=16.998，P<0.001)。在不同的TNM分期中，F(xiàn)OXC2陽性表達率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.193，P<0.01)；進一步兩兩比較顯示，胰腺癌Ⅲ期FOXC2陽性表達率明顯高于Ⅰ期(χ2=15.688，P<0.01)和Ⅱ期(χ2=10.678，P=0.001)。性別、年齡、分化程度、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯等對FOXC2的陽性表達率無明顯影響。見表1。

2.4 FOXC2表達與患者預(yù)后的相關(guān)性

生存曲線(圖4)顯示，F(xiàn)OXC2陽性組中位生存時間較FOXC2陰性組明顯縮短(P=0.001 3)，表明FOXC2陽性患者預(yù)后較FOXC2陰性者差。

Cox回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2陽性表達(P=0.003)是判斷胰腺癌預(yù)后的獨立因素，F(xiàn)OXC2陽性表達患者與陰性表達患者相比，死亡風(fēng)險更高(HR=2.569，95%CI：1.384～4.767)。

表1 FOXC2蛋白表達與胰腺癌患者臨床資料關(guān)系

圖4 FOXC2表達與患者生存時間的關(guān)系

3 討論

本研究通過檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在Badea和Pei芯片數(shù)據(jù)中FOXC2 mRNA表達在胰腺癌癌組織中均顯著上調(diào)。此外，本實驗結(jié)果顯示FOXC2 mRNA在胰腺癌組織中的表達明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，證實FOXC2基因在胰腺癌組織中呈過表達，提示FOXC2可能與胰腺癌發(fā)展相關(guān)。

多項研究證實FOXC2表達參與惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[21-22]，此外，研究表明，F(xiàn)OXC2誘導(dǎo)腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且貫穿于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程[23-25]。FOXC2與食管癌[26]、胃癌[27]、結(jié)腸癌[28]、非小細胞肺癌[29]、原發(fā)性肝細胞癌[30]以及乳腺癌[31]的預(yù)后密切相關(guān)。Watanabe等[28]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2的表達與結(jié)腸癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移程度顯著相關(guān)，結(jié)腸癌患者中N2期者FOXC2的表達水平較N1期者明顯增加。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，癌組織中FOXC2蛋白表達明顯增高，進一步證實FOXC2在胰腺癌組織中呈高表達，且FOXC2的表達水平與胰腺癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。由此表明，F(xiàn)OXC2陽性表達可能與胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，但尚待動物模型及細胞實驗進一步驗證。此外，本實驗結(jié)果顯示FOXC2陽性表達可作為判斷胰腺癌預(yù)后的獨立因素，對臨床具有一定指導(dǎo)意義。由于本研究病理組織來自同一醫(yī)院，可能存在選擇偏倚，上述結(jié)果尚需多中心研究進一步證實。

綜上所述，本研究證實FOXC2在胰腺癌組織中呈過表達，其參與胰腺癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，且與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)。