遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義 563006

白芨是一種珍稀名貴中藥材，為蘭科植物白芨(Bletillastriata)的干燥塊莖，其味苦、甘、澀，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌等功效[1]，野生品主產(chǎn)于貴州、四川和湖南等地，已被列為國家瀕危珍稀植物保護(hù)名錄[2]。藥理學(xué)研究表明，白芨具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌和促進(jìn)傷口愈合等作用[3]。近年來，白芨在抗腫瘤方面時(shí)有報(bào)道[4-6]，其主要活性成分為大量含有的多糖類物質(zhì)。

白芨中的主要化學(xué)成分有多糖類、菲類、聯(lián)菲類、聯(lián)芐類、甾體和三萜類等物質(zhì)。菲類化合物是目前報(bào)道從白芨塊莖中分離得到的較多的一類化學(xué)成分，該類化合物芳環(huán)上的取代基主要有羥基、甲氧基和對(duì)羥芐基，是白芨中的主要活性成分，聯(lián)菲類化合物主要有白芨聯(lián)菲A、B、C和白芨聯(lián)菲醇A、B、C[7-9]。聯(lián)芐類化合物是白芨中的另一大類化學(xué)成分，也是生物合成菲類化合物的前體物質(zhì)。此外，白芨中還分離得到了較為特殊的C-31和C-32環(huán)菠蘿蜜烷型三萜化合物[10]，C-32環(huán)菠蘿蜜烷型三萜只在少數(shù)幾種植物中被報(bào)道，兩個(gè)1位氧苷的甾體皂苷據(jù)報(bào)道具有很好的抗腫瘤活性[11]。本研究對(duì)白芨進(jìn)行水提醇沉提取白芨粗多糖，同時(shí)保留有機(jī)小分子物質(zhì)部分，使用人肝癌HepG2細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，以期能為白芨的后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥材與細(xì)胞 白芨藥材購買于遵義市百姓人大藥房，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室吳發(fā)明博士鑒定為蘭科植物白芨屬白芨的干燥塊莖。人肝癌HepG2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 胎牛血清、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青霉素/鏈霉素溶液購買于美國Gibco公司；二甲基亞砜購買于美國Sigma公司；PBS緩沖液粉末購買于北京鼎國生物科技有限公司；CCK8試劑購于江蘇碧云天生物科技有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購買于北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器 Heracell 240i二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；IX73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Spectra max plus 384酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；TD5M離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法

2.1 白芨多糖的制備 取白芨藥材粉末50 g，蒸餾水加熱提取3次后，合并提取液，減壓濃縮至粘稠，緩慢加入無水乙醇使體系乙醇終濃度達(dá)80%，4 ℃靜置過夜，離心，分別收集沉淀和上清液。沉淀減壓干燥即得白芨粗多糖，上清液減壓濃縮得其他物質(zhì)部分(主要為有機(jī)小分子物質(zhì))。經(jīng)計(jì)算，1 g白芨藥材可提取粗多糖0.368 g。用蒸餾水復(fù)溶粗多糖后，Sevage法除蛋白，再采用硫酸-苯酚法測(cè)得多糖含量為(72.45±6.01)%，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞存活率的測(cè)定 將生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，分別給予不同濃度(10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL和160 μg/mL)的白芨多糖和有機(jī)小分子物質(zhì)處理48 h后，各組加入CCK8試劑20 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后終止顯色，并于450 nm檢測(cè)波長測(cè)定其吸光度值。

2.3 細(xì)胞生長曲線的測(cè)定 將生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，以1 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，按分組情況進(jìn)行處理，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d。于每天定時(shí)取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后取出，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔吸光度值，以吸光度值表示細(xì)胞增殖能力大小，繪制生長曲線。

2.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察 將生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，按分組情況進(jìn)行處理48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.5 細(xì)胞克隆的形成 將生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞使用胰蛋白酶消化，使之成為單細(xì)胞懸液，再用2×培養(yǎng)基(含20%的胎牛血清和2%的抗生素)調(diào)整細(xì)胞密度至1 000個(gè)細(xì)胞/mL待用。按1∶1比例使1.2%的瓊脂糖和2×培養(yǎng)基混合，將混合液以1.5 mL/孔接種于6孔板中，室溫放置30 min冷卻凝固后，作底層瓊脂置37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中備用。按1∶1比例使0.6%的瓊脂糖和含有適當(dāng)密度細(xì)胞懸液的2×培養(yǎng)基混合后，將混合液以1 mL/孔接種于鋪有1.2%底層瓊脂的6孔板中，形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。待克隆形成后，將6孔板置于倒置顯微鏡，觀察細(xì)胞克隆大小，并采集圖像。

3 結(jié)果

3.1 白芨水提物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響 經(jīng)不同濃度的白芨水提物作用48 h后，HepG2細(xì)胞存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并具有濃度效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組相比，多糖濃度為10 μg/mL時(shí)，存活細(xì)胞下降至90.96%；隨著作用濃度升高，當(dāng)提取物濃度達(dá)到20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL和160 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率分別為85.44%、60.85%、45.94%和33.04%，并均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，白芨水提物中的有機(jī)小分子物質(zhì)部分對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率顯示出更好的抑制作用，當(dāng)作用濃度為20 μg/mL，細(xì)胞的存活率則下降至69.91%。經(jīng)計(jì)算，多糖和有機(jī)小分子物質(zhì)作用HepG2細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為65.99 μg/mL和52.62 μg/mL?；诖?，本研究選用25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL分別作為低、中和高濃度進(jìn)一步研究白芨水提物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和細(xì)胞形態(tài)的影響。如圖1所示。

3.2 白芨水提物對(duì)HepG2細(xì)胞生長曲線的影響 細(xì)胞生長曲線是觀察細(xì)胞生長基本規(guī)律的重要方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。對(duì)于貼壁細(xì)胞而言，細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮后便會(huì)貼壁生長，隨后度過長短不同的潛伏期，隨即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，通過比較加藥組與對(duì)照組之間腫瘤細(xì)胞在連續(xù)一段時(shí)間內(nèi)的生長情況，從而判斷腫瘤細(xì)胞在藥物的作用下增殖情況是否受到影響。在對(duì)照組中，隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長，測(cè)得的OD值呈上升趨勢(shì)，表示其孔中細(xì)胞數(shù)目在不斷增多，細(xì)胞生長在持續(xù)進(jìn)行。在經(jīng)不同濃度的白芨水提物處理后，HepG2細(xì)胞的生長受到了明顯抑制，其測(cè)定的OD值基本呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，作用時(shí)間越長，生長的細(xì)胞數(shù)目越少，提示白芨水提物在體外顯著抑制了人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖作用。如圖2所示。

2.3 白芨水提物對(duì)HepG2細(xì)胞生長形態(tài)的影響 對(duì)照組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，形態(tài)正常，為不規(guī)則的梭形，且細(xì)胞周圍未出現(xiàn)變亮區(qū)域。隨著白芨水提物作用濃度的增大，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。低濃度處理的白芨水提物組(25 μg/mL)，大部分細(xì)胞仍然呈現(xiàn)正常形態(tài)，而使用中、高濃度的白芨水提物進(jìn)行孵育后(50 μg/mL和100 μg/mL)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞松散，體積縮小，呈現(xiàn)固縮的圓形結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞周圍變亮，細(xì)胞貼壁疏松，并有部分細(xì)胞漂浮。白芨水提物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響。如圖3所示。

2.4 白芨水提物對(duì)HepG2細(xì)胞克隆形成的影響 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)(softagarassay)是腫瘤研究領(lǐng)域中一項(xiàng)重要的體外實(shí)驗(yàn)，將處理后的腫瘤細(xì)胞(單細(xì)胞懸液)接種于軟瓊脂中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)有腫瘤特性的細(xì)胞就能形成一個(gè)克隆，通過觀察克隆體積或計(jì)算克隆數(shù)量，從而了解腫瘤細(xì)胞的生長狀況及增殖能力。經(jīng)不同濃度的白芨水提物作用后，細(xì)胞克隆體積與對(duì)照組相比明顯變小，說明白芨水提物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的生長增殖情況顯現(xiàn)出顯著的抑制作用。如圖4所示。

4 討論

中藥治療癌癥具有多靶點(diǎn)、毒副作用小等特點(diǎn)，白芨作為我國傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久，藥用價(jià)值高。多糖作為白芨的主要活性物質(zhì)，不但參與了細(xì)胞生命代謝，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)和抗腫瘤等方面均能發(fā)揮作用[12-13]。有研究報(bào)道，白芨多糖腹腔注射給藥后，對(duì)小鼠子宮頸癌、小鼠艾氏腹水癌、實(shí)體型小鼠肝癌、肉瘤等均有抑制作用[14]。

雖然白芨中多糖含量較高，是其主要藥效成分，但白芨中相對(duì)含量較低但活性較高的有機(jī)小分子組分是否也具有較好的抗腫瘤活性，且白芨中單體物質(zhì)的抗腫瘤活性研究仍較少。因此，本研究對(duì)白芨進(jìn)行水提醇沉制備白芨多糖，同時(shí)保留有機(jī)小分子物質(zhì)部分，選用人肝癌HepG2細(xì)胞，研究其對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，白芨水提物中的多糖和有機(jī)小分子物質(zhì)均可抑制HepG2細(xì)胞的增殖作用。此外，白芨抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)及深入的藥理機(jī)制和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也值得進(jìn)一步研究與探討。