魏 凱，蔡紅英，陳春山，張旭光，郭弘藝，李 超，馬 龍，郭明磊

(1. 北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京 102100； 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3. 北京市鱘魚鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，北京 102100； 4. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090)

細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)，隸屬鮭形目(Salmoniformes)，鮭科(Salmonidae)，細(xì)鱗鮭屬，多分布于西伯利亞、朝鮮半島和中國(guó)的黑龍江、圖們江、鴨綠江等水域，在秦嶺和北京地區(qū)部分水系有零星分布，屬冷水性珍貴魚類。春季雨水引起河水上漲時(shí)，細(xì)鱗鮭由江河進(jìn)入具有清水的支流中，一般生活在支流的山澗深潭中，秋季支流的水變淺時(shí)，由支流進(jìn)入江河中越冬。隨著不同年份洪水的情況，細(xì)鱗鮭向主河道洄游的時(shí)間略有不同。由于環(huán)境惡化和棲息地環(huán)境變化等原因，細(xì)鱗鮭的分布區(qū)域逐漸縮小，野生資源量也日益減少，對(duì)細(xì)鱗鮭野生種群的保護(hù)已迫在眉睫[1]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)細(xì)鱗鮭繁殖生物學(xué)[1]、棲息地的地理環(huán)境因子[2]等展開了研究，但對(duì)其洄游行為的研究相對(duì)較少。鮭類洄游機(jī)制具有嗅覺印跡和性外激素誘導(dǎo)兩種假設(shè)[3-5]。最近，有研究提出大馬哈魚(Oncorhynchusketa)可利用其出生地的單體氨基酸進(jìn)行洄游的假設(shè)[6]。支流水體中化學(xué)成份的研究表明，其常見的水溶性單體氨基酸有谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)等[7-10]。細(xì)鱗鮭由主河道進(jìn)入支流的習(xí)性，尚不清楚是否為支流水體中主要單體氨基酸對(duì)其嗅覺行為的影響。本實(shí)驗(yàn)采用Y型迷宮，研究了4種主要水溶性氨基酸對(duì)細(xì)鱗鮭嗅覺行為的影響，以期一定程度闡明細(xì)鱗鮭的洄游行為機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)鱗鮭幼魚來(lái)自吉林省延邊細(xì)鱗鮭良種場(chǎng)，平均體質(zhì)量(6.0±2.4)g，平均體長(zhǎng)(10.0±1.8)cm。試驗(yàn)魚暫養(yǎng)于冷水機(jī)循環(huán)系統(tǒng)的圓形帆布水槽(1 m×1.6 m)中，平均水溫(13.0±1.5)℃，正常自然光照。暫養(yǎng)期間每日投喂一次人工顆粒餌料。實(shí)驗(yàn)前從暫養(yǎng)水槽隨機(jī)取20尾健康的魚，分別放入位于水槽內(nèi)的隔離網(wǎng)籠進(jìn)行分離暫養(yǎng)48 h，以適應(yīng)封閉環(huán)境，減少實(shí)驗(yàn)應(yīng)激反應(yīng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)在自制的Y型迷宮水槽中(長(zhǎng)80 cm×寬20 cm×高10 cm)進(jìn)行，水槽的一端設(shè)有長(zhǎng)30 cm的擋板，將水槽一端分成左右兩個(gè)同樣的選擇區(qū)A、B(圖1)。兩種相同濃度的氨基酸溶液通過調(diào)節(jié)閥以相同的速度(2 mL·s-1)流入選擇區(qū)。水槽另一端設(shè)有出水口，并通過水流閥控制氨基酸的擴(kuò)散速度，調(diào)節(jié)氨基酸溶液擴(kuò)散至選擇臂末端的時(shí)間為10～12 min。實(shí)驗(yàn)時(shí)，試驗(yàn)魚由活動(dòng)網(wǎng)隔離在選擇區(qū)前方(圖1)，適應(yīng)15 min后移去活動(dòng)網(wǎng)，同時(shí)打開氨基酸刺激液的調(diào)節(jié)閥，并同步視頻記錄試驗(yàn)魚對(duì)不同選擇區(qū)的行為偏好反應(yīng)。為了避免兩種氨基酸在擋板末端混和，實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)間設(shè)置為10 min，并離線分析試驗(yàn)魚的行為反應(yīng)。

分別測(cè)試了20尾細(xì)鱗幼魚對(duì)甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)的選擇偏好性。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)氨基酸母溶液配制濃度為10-3摩爾每升(M)時(shí)，實(shí)驗(yàn)水槽內(nèi)的氨基酸刺激液可對(duì)細(xì)鱗幼魚有較好的吸引效應(yīng)。經(jīng)計(jì)算，氨基酸母溶液擴(kuò)散至擋板末端時(shí)實(shí)驗(yàn)水槽內(nèi)實(shí)際濃度約為2.5×10-6M。為了比較試驗(yàn)魚對(duì)上述氨基酸的偏好性，隨機(jī)選擇以甘氨酸為參照進(jìn)行兩兩比較分析，分別進(jìn)行了Gly vs Glu、Gly vs Ala、Gly vs Asp 3組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用水與暫養(yǎng)水同，以減少試驗(yàn)魚的應(yīng)激反應(yīng)。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the Y-maze flow-through system

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中，細(xì)鱗鮭幼魚對(duì)某一種氨基酸的行為選擇偏好性，主要因素為氨基酸種類。試驗(yàn)魚選擇偏好性主要由試驗(yàn)魚是否進(jìn)入選擇區(qū)，以及在選擇區(qū)的停留時(shí)間決定。依據(jù)ZHANG等[11]、張旭光[ 12]研究，試驗(yàn)魚對(duì)某一氨基酸的絕對(duì)偏好度(preference degree)定義為P=(N×Ta)/Tl，式中：P為絕對(duì)偏好度；N為進(jìn)入頻次；Ta為進(jìn)入選擇區(qū)的平均停留時(shí)間(activity time)；Tl為第一次進(jìn)入選擇區(qū)的反應(yīng)時(shí)間或延遲時(shí)間(latency time)。該公式表明，絕對(duì)偏好度與試驗(yàn)魚在選擇區(qū)的停留時(shí)間成正比，停留時(shí)間越長(zhǎng)，選擇偏好性越大；與試驗(yàn)魚第一次趨向選擇某種氨基酸的延遲時(shí)間成反比，延遲時(shí)間越長(zhǎng)表明偏好性越小。

為了確定試驗(yàn)魚群體對(duì)4種氨基酸的偏好性差異，將甘氨酸(Gly)的絕對(duì)偏好度標(biāo)準(zhǔn)化為1，根據(jù)公式Rx=Px/PGly進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化計(jì)算對(duì)應(yīng)的氨基酸的相對(duì)偏好有效值[13]，其中Rx為氨基酸的相對(duì)偏好有效值，Px為氨基酸的絕對(duì)偏好度，PGly為甘氨酸的絕對(duì)偏好度。根據(jù)相對(duì)偏好有效值的大小來(lái)確定細(xì)鱗鮭幼魚對(duì)不同氨基酸的行為選擇偏好性大小順序。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)來(lái)表示，由Sigmaplot(Version 12.5)進(jìn)行繪制圖表和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗅覺行為反應(yīng)

在實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)間內(nèi)，大多數(shù)細(xì)鱗鮭幼魚(n=56，93%)都表現(xiàn)出對(duì)單體氨基酸的正趨向反應(yīng)，但也有個(gè)別幼魚(n=4)在記錄結(jié)束才表現(xiàn)出趨向反應(yīng)。在經(jīng)過一定反應(yīng)延遲時(shí)間后能一次或數(shù)次進(jìn)入前方的選擇區(qū)，反應(yīng)延遲時(shí)間為289～398 s，平均時(shí)間為(329±14)s，該時(shí)間可能與氨基酸的擴(kuò)散速度以及試驗(yàn)魚對(duì)氨基酸嗅覺敏感性有關(guān)。細(xì)鱗鮭幼魚在選擇區(qū)通常停留一段時(shí)間，為12～400 s，平均停留時(shí)間為(90±11)s。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)鱗鮭幼魚(71%)會(huì)同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)兩種氨基酸的偏好，它們往往選擇進(jìn)入一側(cè)氨基酸區(qū)后也選擇進(jìn)入另一側(cè)選擇區(qū)，但實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)有的試驗(yàn)魚(29%)只選擇在一側(cè)選擇區(qū)停留。

2.2 偏好度分析

在3組兩兩對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)魚對(duì)參照組甘氨酸(Gly)的平均偏好度分別為(0.50±0.16)、(0.42±0.11)和(0.58±0.12)，3組間試驗(yàn)魚甘氨酸(Gly)的偏好度無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖2)。在Gly vs Ala比較組中，試驗(yàn)魚對(duì)Gly的平均選擇偏好度(0.50±0.16)略小于Ala (0.60±0.13)，但二者差異不顯著(P>0.05)；但在Gly vs Glu組，試驗(yàn)魚對(duì)Glu的平均偏好度(0.82±0.19)大于Gly(0.42±0.11)，且二者差異達(dá)顯著性水平(P<0.05)；在Gly vs Asp組，試驗(yàn)魚對(duì)Asp的平均偏好度(0.70±0.15)略大于Gly(0.58±0.12)，但二者未達(dá)顯著性差異水平(P>0.05)。

圖2 細(xì)鱗鮭幼魚對(duì)氨基酸的偏好度Fig.2 Preference degree to amino acids in Brachymystax lenok注：* 表示差異顯著(P<0.05)Note: * means significant differences (P<0.05)

根據(jù)Rx=Px/PGly計(jì)算，細(xì)鱗鮭幼魚對(duì)4種氨基酸的相對(duì)偏好度有效值分別為1(Gly)、1.18(Ala)、1.98(Glu)、1.27(Asp)。依據(jù)相對(duì)偏好度有效值大小，細(xì)鱗鮭對(duì)氨基酸的偏好性順序?yàn)楣劝彼?Glu)>天冬氨酸(Asp)>丙氨酸(Ala)>甘氨酸(Gly)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過行為學(xué)的方法研究了細(xì)鱗鮭幼魚對(duì)谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)4種單體氨基酸的偏好反應(yīng)。試驗(yàn)魚對(duì)氨基酸的平均反應(yīng)延遲時(shí)間為300 s以上，表明試驗(yàn)魚對(duì)氨基酸的反應(yīng)存在刺激閾值濃度。假設(shè)氨基酸母溶液以勻速擴(kuò)散，那么引起試驗(yàn)魚進(jìn)入選擇區(qū)的實(shí)際氨基酸濃度約為1×10-6M，與引起魚類的嗅覺行為反應(yīng)的刺激閾值濃度相一致[14]。而高于閾值濃度的刺激則會(huì)引起魚類的逃避或抑制反應(yīng)[15]。這也可以解釋，試驗(yàn)魚在進(jìn)入選擇區(qū)后通常停留一段時(shí)間后離開的現(xiàn)象。

根據(jù)相對(duì)偏好度的有效值，細(xì)鱗鮭幼魚嗅覺反應(yīng)最敏感的為谷氨酸，其次為天冬氨酸、丙氨酸和甘氨酸。這可能與細(xì)鱗鮭嗅覺對(duì)氨基酸的生理敏感性有關(guān)。但對(duì)于上述4種氨基酸，虹鱒(Salmogairdneri)嗅覺電生理研究表明，其嗅覺上皮對(duì)丙氨酸(Ala)最敏感，其嗅電圖反應(yīng)的相對(duì)有效幅值較高，達(dá)108，而其它氨基酸的有效幅值較低(Gly:102; Glu:59.2; Asp:42)[16-17]，虹鱒嗅覺上皮對(duì)氨基酸敏感性大小順序?yàn)椋罕彼?Ala)>甘氨酸(Gly)>谷氨酸(Glu)>天冬氨酸(Asp)。雖然現(xiàn)階段沒有基于氨基酸刺激的細(xì)鱗鮭嗅覺電生理研究資料，但基于已報(bào)道的虹鱒的嗅覺電生理研究資料和本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推測(cè)細(xì)鱗鮭對(duì)氨基酸的行為敏感性可能與其嗅覺上皮的氨基酸生理敏感性相匹配。這一假設(shè)還需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中開展細(xì)鱗鮭嗅電圖反應(yīng)的研究來(lái)驗(yàn)證。

嗅覺行為研究也證實(shí)了單體氨基酸可以有效地刺激魚類的攝食行為[18]。例如，未開口的虹鱒和大西洋鮭幼魚，經(jīng)丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸等單體氨基酸刺激，可誘發(fā)其攝食相關(guān)的行為反應(yīng)，如咬合(snapping)、游泳加速(darting)等[19]。因此，鮭類對(duì)氨基酸的敏感性及其反應(yīng)可能是一種內(nèi)源性行為。單體氨基酸也可以誘發(fā)鮭類幼魚形成嗅覺印跡[20]。嗅覺印跡是魚類一種主要洄游機(jī)制，產(chǎn)生嗅覺印跡的因素還涉及各種性外激素[5, 21]或同類的氣味[3, 6]。行為學(xué)和電生理的研究都顯示單體氨基酸的嗅覺印跡是鮭類生殖洄游的重要機(jī)制[8, 20, 22-23]。Y型迷宮選擇實(shí)驗(yàn)也表明，生殖期的馬蘇大馬哈魚(Oncorhynchusketa)對(duì)氨基酸種類和含量配比與其出生地相似的人工刺激液具有明顯的選擇偏好[22]。同時(shí)，該人工刺激液誘發(fā)了馬蘇大馬哈魚幅值較高的嗅電圖電位，而對(duì)無(wú)機(jī)鹽或膽酸配比相似的人工刺激液的反應(yīng)則較小[8]。這些研究都表明鮭類對(duì)氨基酸的敏感性在其洄游行為中起著重要的線索作用[8, 22-23]。

在對(duì)馬蘇大馬哈魚的棲息地天鹽川河(Teshio River)中水溶性氨基酸成分和含量進(jìn)行的5年(2006-2010年)跟蹤調(diào)查表明，在自然條件下，氨其酸的成分是基本穩(wěn)定的，7種氨基酸丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、絲氨酸和纈氨酸在5年內(nèi)變化差異較小，其中丙氨酸和天冬氨酸含量最高[8]。同樣，對(duì)細(xì)鱗鮭棲息河流的水溶性氨基酸調(diào)查也表明，其氨基酸總量為4.2～13.8 μM，其中單體氨基含量20%左右，約為0.84～2.76 μM[7]。本實(shí)驗(yàn)中，氨基酸的實(shí)際效應(yīng)濃度為1.00～2.58 μM，與自然水域的氨基酸濃度相接近。細(xì)鱗鮭對(duì)谷氨酸保持的顯著敏感性，一方面由其嗅覺上皮的生理敏感性決定，另一方面與自然棲息水域中谷氨酸最高含量的特點(diǎn)相匹配。但同時(shí)，細(xì)鱗鮭也保持了對(duì)其它幾種主要氨基酸的行為偏好性。這表明，不同流域或其支流的主要氨基酸成分的差異可能決定不同種鮭類的氨基酸行為選擇偏好。馬蘇大馬哈魚對(duì)氨基酸比例相似的人工刺激液表現(xiàn)出與棲息地水溶液相似的反應(yīng)[8]，也可以說明這一點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，只驗(yàn)證了試驗(yàn)魚對(duì)單個(gè)氨基酸的行為反應(yīng)，對(duì)兩種或多種的混和氨基酸行為反應(yīng)還待進(jìn)一步研究。

細(xì)鱗鮭肌肉中的谷氨酸(1.75%干重)、天冬氨酸(1.59%)、甘氨酸(0.85%)和丙氨酸(0.75%)，也是其所有氨基酸中含量較高的幾種[24]。每年的4-6月，性成熟的細(xì)鱗鮭有從中游溯河至上游進(jìn)行生殖洄游的習(xí)性，繁殖后有部分親魚死于棲息地[25]，單體氨基酸從魚體釋放和溶解可能是部分水體中的主要氨基酸的來(lái)源。另一方面，上游新鮮程度較高的有機(jī)物排放也影響水體中的氨基酸成分和含量變化。保護(hù)細(xì)鱗鮭野生資源的最終目標(biāo)是使其能夠在自然條件下繁殖，恢復(fù)群體數(shù)量[25]。在細(xì)鱗鮭生殖期，保證其上游水體以及其溯河通道水域的氨基酸成分的穩(wěn)定是提高細(xì)鱗鮭溯河生殖洄游效率的重要保證。如今，人類活動(dòng)的各種化學(xué)污染可能會(huì)阻斷細(xì)鱗鮭的洄游路徑，從而影響其自然繁殖的成功率。因此，對(duì)細(xì)鱗鮭野生資源的保護(hù)還涉及水體中氨基酸的長(zhǎng)期監(jiān)控，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制排放源。