喻 杰，付元帥，施志儀

(上海海洋大學水產與生命學院，農業(yè)部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306)

甲狀腺素(TH)是一類氨基酸衍生物，其在魚類早期發(fā)育過程中具有重要的調控作用。甲狀腺素是由甲狀腺素受體(TR)介導發(fā)揮作用的，研究證實，在TR介導TH基因轉錄的過程中，一系列的TR結合蛋白參與其中[1]。這些結合蛋白中，一些具有組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyl transferases, HATs)或組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)活性，它們通過對組蛋白特定氨基酸的乙酰化或去乙酰化修飾來重塑染色質結構。如果組蛋白尾部的賴氨酸殘基被HAT乙?；瑒t染色質結構會變松散，聚合酶II更易進入，從而啟動轉錄。如果組蛋白尾部賴氨酸殘基被HDAC去乙?；瑒t染色質將變得緊湊，使得聚合酶II難以進入，導致轉錄抑制[2]。另外，TR還可以通過蛋白和蛋白結合的形式直接發(fā)揮作用。如TR可以與細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的CREB區(qū)域結合，阻止其磷酸化；對小鼠甲狀腺腫瘤細胞的研究發(fā)現(xiàn)，TRβ還可以與磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的p85α C末端的SH2區(qū)域結合[3]，令其磷酸化，使得介導的下游通路發(fā)生級聯(lián)激活反應。

免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)是以抗原和抗體之間的專一性免疫反應為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定蛋白質在完整細胞內生理性環(huán)境下天然相互作用的有效方法。通過抗體在細胞總蛋白裂解液中捕獲抗原及與抗原相互作用的蛋白，經過適當?shù)叵疵?，收集免疫復合物，然后分離蛋白質，加以質譜鑒定，從而得到蛋白的氨基酸序列及種類信息[4]。牙鲆(Paralichthysolivaceus)是一種重要的海水經濟養(yǎng)殖魚類，其從仔魚到稚魚的發(fā)育經過一個重要的變態(tài)發(fā)育過程，該過程受甲狀腺素的調控，而甲狀腺素是由TR介導發(fā)揮作用的。關于甲狀腺素在牙鲆變態(tài)過程中對相關功能基因影響的研究已有報道[5-7]。本研究以甲狀腺素受體β(TRβ)為研究對象，制作多克隆抗體，利用免疫沉淀法在牙鲆胚胎細胞中探索TRβ的相互作用蛋白，以期進一步了解甲狀腺素受體介導甲狀腺素調控牙鲆變態(tài)過程，為牙鲆變態(tài)的分子機制研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 牙鲆胚胎細胞

本研究所用的牙鲆胚胎細胞(flounder embryonic cells，F(xiàn)EC)來自中國水產科學研究院黃海水產研究所陳松林老師的饋贈，在本實驗室細胞培養(yǎng)室連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方法參照CHEN等[8]的研究。

1.2 牙鲆仔魚實驗

牙鲆仔魚實驗在中國水產科學研究院北戴河中心實驗站進行，培育溫度為19～21°C。將孵化后第15天(15 dph)的仔魚隨機分成3組(每組3個缸，每缸2 000尾魚)，飼養(yǎng)直至41 dph。3組分別為：正常對照組(NC)：在天然海水中飼養(yǎng)；TH組：在含有0.1 mg·L-1TH(L-甲狀腺素，T4；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的海水中飼養(yǎng)；TU組：在含30 mg·L-1硫脲(上海生工)的海水中飼養(yǎng)[9]。在21 dph(變態(tài)早期)和28 dph(變態(tài)高峰期)時采集各個實驗組樣品，收集的牙鲆幼體用DEPC水洗滌并用MS-222(125 mg·L-1；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)進行麻醉，然后在液氮中速凍并在-80 ℃下儲存直至使用。

1.3 牙鲆TRβ多克隆抗體制備

牙鲆TRβ多克隆抗體交由上海友科生物科技有限公司制備。制備流程為：表達載體構建-蛋白表達純化回收-兔子免疫-抗體純化。

1.4 免疫沉淀

待細胞長滿培養(yǎng)瓶底，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，第二次洗滌后吸干PBS，加入預冷的2 mL裂解液和20 μL PMSF混合液，吹打使其充分融合，在-80 ℃冰箱中反復凍融3次，每10 min一次；超聲破碎：功率200 W，5 s沖擊，9 s間隙，共60次；經過超聲處理的樣品在4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，去除不溶物質；立即將上清液轉移到新的離心管中；BCA法對總蛋白進行定量檢測；取提取的蛋白1 mg，加入TRβ 多克隆抗體(5 μL)、適量PBS、甘油，IP結合體系為 1 mL，甘油終濃度為10 %。4 ℃搖床孵育過夜；次日，取60 μL protein A/G，加入10倍protein A/G體積的PBS進行清洗，重復4次；清洗結束后加入10倍protein A/G體積的IP buffer平衡1次，將清洗平衡后的protein A/G按每個樣品60 μL加入到昨日的抗體蛋白復合物中，4 ℃結合2 h，結合完成后，用10倍體積的IP buffer清洗4次；加入適量體積的PBS及1×SDS loading buffer，沸水中煮10 min，用于后續(xù)分析。以兔IgG替代TRβ 多克隆抗體作為對照組(control)，同步進行免疫沉淀。

1.5 Western Blot檢測IP復合物

取免疫沉淀得到的蛋白復合物10 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉，以TRβ 多克隆抗體為一抗進行免疫反應，緊接著孵育二抗，超敏ECL化學發(fā)光法顯色拍照。

1.6 質譜檢測IP復合物

取IP復合物進行SDS-PAGE電泳，切下含目的條帶和蛋白marker的膠塊，利用天根生物的試劑盒進行考馬斯亮藍染色脫色。脫色完成后，切下含目的蛋白的膠塊進行膠內酶解。樣品處理完成后，進行液質聯(lián)用質譜分析。

1.7 牙鲆仔魚總RNA提取和cDNA合成

將牙鲆仔魚混合樣品100 mg左右，加入1 mL Trizol，吹打并研磨，然后依照Trizol Reagent試劑盒方法提取總RNA，總RNA用NANODROP 2000測定OD 260/OD280值及濃度，再用1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA ( 1.0 μg) 完整性。確認RNA質量能夠滿足后續(xù)實驗要求后，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA用DNase I處理后，作為模板，按照Promega公司試劑盒說明書方法進行反轉錄，反轉錄得到的cDNA直接用于PCR擴增或-20 ℃保存。

1.8 實時熒光定量PCR

從NCBI網(wǎng)站的GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中獲取相應基因的mRNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件(Premier，Canada)設計用于定量RT-PCR的引物(表1)。使用20 μL反應體積進行PCR擴增反應：1 μL cDNA模板，上下游引物各0.5 μL (10 μM)，10 μL THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO，Osaka，Japan)，8 μL ddH2O。反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；61 ℃ 15 s；72 ℃ 20 s，采集熒光39次，然后進行融解曲線的擴增。實驗設置生物學重復3個，技術重復2次。實驗前首先制備目的基因和內參基因的標準曲線。18s在牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中具有恒定的表達，故本研究選擇其為內參基因。標準曲線結果顯示目的基因和內參基因的R值均大于0.99，相應的擴增效率(E)均介于95 %～100 %之間，并且目標基因和內參基因的M值相差小于0.1。基因相對表達量數(shù)據(jù)運用2-ΔΔCT方法計算[10]，其數(shù)值用平均值±標準誤差(mean±SE)表示，n=3。數(shù)據(jù)采用Sigamplot 10.0軟件中的One-Way方差分析 (ANOVA)，使用Dunnett’s T 多重比較法進行相對表達分析，當P<0.05時表示差異顯著。

表1 研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

注：F和R分別代表上游引物和下游引物；Q-RT-PCR：熒光定量PCR

Note: F and R denote forward and reverse primers, respectively; Q-RT-PCR: quantitative real-time PCR

2 結果與分析

2.1 牙鲆TRβ多克隆抗體的制備和檢測

原核表達的TRβ蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳檢測正確后純化回收進行兔子免疫。4次免疫完成后采集檢測血清小樣，抗血清效價符合標準后采全血分離抗血清。利用抗原親和純化柱對抗血清進行抗原親和純化，獲得特異性抗體。最終獲得抗原親和純化抗體3.6 mg，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)結果顯示抗體效價≥1∶80 000，符合標準。

將TRβ多克隆抗體以1∶1 000體積比稀釋后作為一抗，HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG以1∶2 000體積比稀釋后作為二抗，分別對牙鲆胚胎細胞和牙鲆組織總蛋白質樣品進行Western blot實驗。結果如圖1，在牙鲆細胞和組織樣品中均檢測到了信號，TRβ蛋白大小為43 kDa，在圖1中顯示為40 kDa蛋白marker左右的條帶。該結果表明制備的牙鲆TRβ多克隆抗體在稀釋1000倍時仍能識別牙鲆細胞和組織中的TRβ蛋白，說明該TRβ多克隆抗體具有良好的特異性。

圖1 TRβ多克隆抗體用于牙鲆細胞和組織總蛋白的Western BlotFig. 1 Western Blot analysis of the TRβ polyclonal antibody against total proteins from FECs and P. olivaceus tissues 注：M：蛋白質量標準；1：牙鲆胚胎細胞總蛋白WB；2：牙鲆組織總蛋白WB。箭頭所指為牙鲆TRβ蛋白信號Note: M: protein marker; 1: FECs total protein WB; 2: P. olivaceus tissues total protein WB. The arrow shows signal of P. olivaceus TRβ protein

2.2 免疫沉淀

2.2.1 Western Blot檢測免疫沉淀復合物

本研究利用免疫沉淀技術(Immunoprecipitation，IP)，以牙鲆胚胎細胞為對象，探索與牙鲆TRβ相互作用的蛋白質。實驗設置3個組，第一組：input為牙鲆胚胎細胞總蛋白直接上樣，上樣量24 μg；第二組：IP為TRβ抗體與牙鲆胚胎細胞總蛋白的免疫沉淀復合物，共沉淀了978 μg蛋白，上樣量10 μL；第三組：對照組control為兔IgG與牙鲆胚胎細胞總蛋白的免疫沉淀復合物，沉淀量1 mg，上樣量5 μL。以TRβ多克隆抗體檢測免疫沉淀復合物中是否存在TRβ蛋白，實驗結果顯示，在細胞總蛋白和TRβ抗體與牙鲆胚胎細胞總蛋白的免疫沉淀復合物中均檢測到大小在43 kDa左右的片段，與TRβ蛋白的大小相符，對照組則沒有檢測到TRβ蛋白信號，僅檢測到2個大小分別在25 kDa和55 kDa左右的片段，推測為用于免疫沉淀的抗體存留在免疫沉淀復合物中所顯示的信號，同樣在TRβ抗體與牙鲆胚胎細胞總蛋白的免疫沉淀復合物中也檢測到這兩個條帶信號(圖2)。Western Blot檢測結果表明免疫沉淀實驗效果較好，沉淀復合物可用于后續(xù)質譜檢測分析。

圖2 免疫沉淀復合物的Werstern Blot檢測Fig.2 Werstern Blot detection of immunoprecipitation complexes注：Input：細胞總蛋白上樣；IP：TRβ抗體免疫沉淀復合物；Control：兔IgG抗體免疫沉淀復合物。箭頭所指為牙鲆TRβ蛋白信號Note: Input: Cell total protein loading; IP: TRβ antibody immunoprecipitation complex; control: Rabbit IgG immunoprecipitation complex. The arrow shows signal of P. olivaceus TRβ protein

2.2.2 質譜檢測IP復合物

將牙鲆TRβ多克隆抗體與胚胎細胞總蛋白的免疫沉淀復合物經SDS-PAGE凝膠電泳，割取含有目的蛋白的膠條(圖3)，回收蛋白，上機進行LC-MS/MS 90 min質譜鑒定。

圖3 免疫沉淀復合物的SDS-PAGE凝膠電泳考染圖Fig. 3 Immunoprecipitation complex SDS-PAGE gel electrophoresis注：M：蛋白質量標準；IP：TRβ抗體免疫沉淀復合物。箭頭所指為牙鲆TRβ蛋白信號Note: M: Protein marker; IP: TRβ antibody immunoprecipitation complex. The arrow shows signal of P. olivaceus TRβ protein

質譜鑒定數(shù)據(jù)經搜索Mascot數(shù)據(jù)庫查詢結果顯示：本次質譜鑒定的閾值得分是26分(圖4)，大于26分的蛋白為可信蛋白。本研究從牙鲆TRβ多克隆抗體與胚胎細胞總蛋白的免疫沉淀復合物中共鑒定得到了21個與TRβ蛋白可信度高的相互作用牙鲆蛋白(表2)。

圖4 肽段得分分布Fig. 4 Peptide score distribution注：離子得分以-log10(P)表示，其中P為隨機事件的概率。個體離子得分大于26表示具有同一性或廣泛同源性Note: Ions score is -log10 (P), where P is the probability that the observed match is a random event. Individual ions scores > 26 indicate identity or extensive homology

登錄號GeneBank ID蛋白質名稱Protein name分子量MW蛋白質豐度指數(shù)emPAIdbj|BAF37104.1|ATP synthase beta-subunit177507.08gb|AAO92751.1|heat shock protein 90 beta836571.08dbj|BAD05136.1|hsc71713420.96gb|ABG56396.1|chaperonin containing TCP1 subunit 6A, partial488500.58gb|AAF61072.1|AF220553_140S ribosomal protein S15A150474.08gb|ABB76381.1|heat shock protein 60 kDa612510.37gb|ABU42561.1|creatine kinase 1431440.16dbj|BAE48204.1|solute carrier family 25 alpha, member 5, partial239040.48dbj|BAO53973.1|elongation factor 1 alpha507370.37gb|AAT35603.1|receptor for activated protein kinase C354580.43gb|AAF61071.1|AF220552_1ribosomal protein L17216060.54gb|AAY25400.1|natural killer enhancing factor221560.76gb|ABQ41382.1|cell division cycle 48899490.11gb|AAF61070.1|AF220551_1ribosomal protein L31143391.35gb|ACB97649.1|60S ribosomal protein L30131151.53gb|AFQ38973.1|scinderin-like protein799980.08dbj|BAE48215.1|filamin A, partial226490.15gb|AAO45173.1|splicing factor arginine/serine-rich 3196440.17gb|AFI80898.1|histone H1-like protein212550.16dbj|BAP59753.1|CC chemokine, Paol-SCYA106125470.27dbj|BAD77968.1|type 1 collagen alpha 1137682

隨后筆者進行了蛋白質GO富集分析，從3個方面對鑒定的蛋白進行了注釋：分子功能(GO-MF)，細胞組分(GO-CC)和生物過程(GO-BP)。GO-MF分析結果顯示，這些可信度較高的作用蛋白主要具有ATP結合、未折疊的蛋白質結合、核糖體的結構組成、激酶活性、跨膜轉運蛋白活性、GTP酶活性、翻譯延長因子活性、過氧化物氧還原酶活性、水解酶活性、肌動蛋白絲結合、RNA結合、DNA結合、趨化因子活性以及細胞外基質結構組分這些分子功能。其中參與蛋白數(shù)量最多的分子功能是ATP結合和核糖體的結構組成。GO-CC細胞內組分分析結果顯示，所鑒定的蛋白主要分布在核糖體、細胞質、細胞核、線粒體內膜、染色體以及胞外區(qū)域，其中絕大多數(shù)的蛋白集中在線粒體和細胞質中。GO-BP分析結果顯示，筆者鑒定的這些IP復合物中的蛋白主要參與翻譯、蛋白質折疊和重折疊、細胞氧化還原內穩(wěn)態(tài)、細胞分裂、核小體裝配、雌激素應答、壓力應答以及免疫應答的生物學進程。

同時經KEGG通路分析結果顯示，鑒定的蛋白參與核糖體通路、內質網(wǎng)蛋白加工、MAPK信號轉導通路、剪接體、粘著斑、氧化磷酸化、內吞作用、RNA降解、氨基酸物質代謝、膽汁分泌、信使RNA監(jiān)測通路、細胞周期、沙門氏菌感染、單純皰疹感染以及細胞因子受體相互作用途徑中。

2.2.3 結合蛋白在牙鲆變態(tài)過程中的表達及其對外源激素刺激的反應

鑒于免疫沉淀實驗中蛋白質之間非特異性相互作用以及瞬時相互作用的存在，加之本研究采用了LC-MS/MS上機90min質譜鑒定的高靈敏度，這些都增加了與TRβ非特異性結合蛋白存在的幾率。所以筆者選擇了可信蛋白中質譜比對結果得分以及相對蛋白質豐度指數(shù)最高的7個蛋白作為研究對象，分別為：ATP合酶β亞基(beta-F1-ATPase)、熱休克蛋白90β(Hsp90β)、含有TCP1的伴侶蛋白亞基6A(Cct6A)、40S核糖體蛋白S15A(RPS15A)、肌酸激酶1(CK1)、溶質載體家族25α成員5(Slc25a5)和延伸因子1(EF1a)。利用Primer Premier 5.0軟件(Premier，Canada)在CDS區(qū)內設計定量引物(表1)，以18s rRNA為內參基因，在Bio-Rad CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System上對這7個基因在牙鲆變態(tài)早期(21dph)和高峰期(28dph)的對照組(NC)、TH組以及TU組的相對表達量進行檢測(圖5)。

圖5 IP可信蛋白mRNA在牙鲆21 dph和28 dph的表達及其對外源TH和TU處理的反應Fig. 5 Expression of IP-identifiable protein mRNA in P. olivaceus 21dph and 28dph and their responses to exogenous TH and TU treatments注：圖a～g分別代表beta-F1-ATPase, Hsp90β, Cct6A, RPS15A, CK1, Slc25a5, EF1a的表達。每個mRNA的表達由平均值±標準誤差(SE)(N=3)的誤差棒顯示。帶有星號的值與正常對照(NC)的相應值有顯著差異(P<0.05)Note: a～g represent the expression of beta-F1-ATPase, Hsp90β, Cct6A, RPS15A, CK1, Slc25a5, EF1a, respectively. The means ± standard error (SE) (N=3) of the expression of each mRNA is shown by error bar. Values with asterisk are significantly different (P<0.05) from the corresponding value for the normal control (NC)

對所選蛋白mRNA進行定量檢測分析結果顯示，除了RPS15A和CK1，其余蛋白的mRNA豐度在變態(tài)高峰期(28 dph)均低于變態(tài)早期(21 dph)，且beta-F1-ATPase、Hsp90β、Cct6A、Slc25a5和EF1a對外源甲狀腺素及硫脲處理具有相似的反應(圖5)，它們的表達在牙鲆變態(tài)早期和高峰期均受外源甲狀腺素的顯著下調(P<0.05)，而硫脲處理對它們的表達基本都沒有顯著性影響(P>0.05)，僅Slc25a5在高峰期受硫脲處理顯著下調(圖5-f，P<0.05)。而RPS15AmRNA的表達量在甲狀腺素和硫脲處理后均顯著下降，且在變態(tài)早期和高峰期均如此(圖5-d，P<0.05)。與其余基因截然不同；CK1在外源甲狀腺素處理后其mRNA豐度增長了約5倍，在變態(tài)早期和高峰期均如此，差異極顯著(P<0.01)，而硫脲處理對CK1的表達沒有明顯影響(圖5-g)。

3 討論

免疫沉淀技術主要包括染色質免疫沉淀技術(chromatin immunoprecipitation，Ch IP)、蛋白質免疫沉淀技術(protein immunoprecipitation，PIP)以及放射免疫沉淀技術(radioimmunoprecipitation，RIP)[11]。本研究中所提及的免疫沉淀(IP)為蛋白質免疫沉淀技術，是以抗體和抗原之間的專一性免疫反應作用為基礎，主要用于抗原結合蛋白的定性檢測，是研究蛋白質在細胞內完整生理性作用的有效方法[12-14]。本研究為進一步探索牙鲆TRβ的功能，以牙鲆胚胎細胞為實驗對象，采用溫和裂解的方法，在細胞內自然狀態(tài)下利用定制的牙鲆TRβ多克隆抗體(rabbit TRβ polyclonal antibody)去捕獲細胞內的TRβ蛋白及與之相互作用的蛋白質復合物，再利用蛋白免疫印跡(Western Blot)和LC-MS/MS質譜的方法確定相互作用蛋白，從TRβ多克隆抗體與牙鲆胚胎細胞總蛋白的免疫沉淀復合物中鑒定得到了21個達到本次質譜鑒定閾值得分的可信牙鲆蛋白(表2)。

鑒于本研究免疫沉淀中可能存在的假陽性結果，研究選擇了可信蛋白中質譜比對結果得分以及相對蛋白質豐度指數(shù)最高的7個蛋白作為進一步研究對象，它們分別為：ATP合酶β亞基(beta-F1-ATPase)、熱休克蛋白90β(Hsp90β)、有TCP1的伴侶蛋白亞基6A(Cct6A)、40S核糖體蛋白S15A(RPS15A)、肌酸激酶1(CK1)、溶質載體家族25α成員5(Slc25a5)和延伸因子1(EF1a)。

ATP合酶是位于核糖體內膜上的含有多個亞單位的復合酶分子，在跨膜質子梯度存在的條件下，將ADP轉化成ATP，參與氧化磷酸化和光合磷酸化途徑，是生物體能量代謝的關鍵酶。ATP合酶由F0和F1兩個亞單位組成，β亞基屬于F1亞單位，也是承載ATP合酶催化位點的主要亞基[15-16]。研究證明膜表達的ATP合成酶除了具有合成和水解ATP的活性，還承擔很多其它的生物學功能，例如可以影響內皮細胞血管生成、調節(jié)血清膽固醇的水平、調節(jié)腫瘤細胞胞內酸堿度等[17-18]，而β亞基不僅參與催化作用，還可位于生物膜表面參與各種生理功能[19]。Hsp90β、Hsc71和Hsp60均屬于熱休克蛋白家族同源基因，這是一類在進化過程中高度保守的且在各種生物體中廣泛存在的蛋白。在功能上，它們作為分子伴侶，對細胞內正常生理和應激情況下蛋白內穩(wěn)態(tài)的維持起著至關重要作用[20-21]。研究表明，在急性高溫和低溫脅迫下，鱖(Sinipercachuatsi)體內多種組織中的多種熱休克蛋白表達量增加，且與脅迫作用時間呈現(xiàn)正相關[22]，表明機體調用熱休克蛋白以積極的方式應答并抵御不適溫度對自身產生的傷害。Cct6A是分子伴侶蛋白的一種，可在ATP水解釋放能量的條件下協(xié)助蛋白質的折疊組裝。其包含的TCP1亦屬于熱休克蛋白Hsp60家族，是一種在細胞胞漿中廣泛分布的異型寡聚蛋白，也是目前為止在真核細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)的唯一一個伴侶素蛋白[23-24]。RPS15A是核糖體的結構成分，是蛋白質翻譯不可或缺的。研究發(fā)現(xiàn)在星形細胞瘤、結直腸癌以及前列腺癌中RPS15A的表達均升高，李光耀等[25]利用RNAi技術觀察并分析RPS15A基因對白血病細胞增殖、細胞周期分布及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)對白血病細胞的RPS15A基因進行敲降可阻滯其細胞周期，增加細胞凋亡，從而影響白細胞的增殖。CK1(Creatine kinase 1，肌酸激酶1)是組織中調節(jié)細胞能量代謝的關鍵酶，與細胞的能量反饋調節(jié)、細胞膜的穩(wěn)定性、神經功能、有氧耐力、肌肉收縮有關，主要存在于高能耗組織如骨骼肌、腦、心臟等組織的細胞中[26-28]。研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺機能亢進和甲狀腺機能衰退會導致總肌酸激酶活力的變化，證明甲狀腺素可調節(jié)肌酸激酶及其同工酶的總活性[29-30]。Slc25a5是溶質載體蛋白基因SLC大家族中SLC25小家族的一員，是位于線粒體膜上的一類運輸分子。線粒體膜由作為各種分子的轉運蛋白的蛋白質組成，Slc25a5就是其中一員[31]。SLC25A5(溶質載體家族25，成員5)也被稱為ANT2，在增殖細胞中高度表達，研究發(fā)現(xiàn)癌細胞中的ANT2誘導與糖酵解代謝和癌發(fā)生直接相關，另外ANT2基因的抑制可導致人細胞的生長停滯[32]。延伸因子1-α(EF1a)是真核生物翻譯延伸因子(eEF1)的一個亞基，該蛋白在蛋白質生物合成期間促進氨?；?tRNA與核糖體A位點的GTP依賴性結合，幫助肽鏈的延伸[33]。研究表明，在壓力條件下，細胞可通過調節(jié)EF1和EF2等延伸因子的表達來調節(jié)總蛋白的合成[34]。另外EF1a除了參與蛋白質的翻譯過程外，還具有許多其它的重要功能，如可以充當分子伴侶保護相關蛋白免受環(huán)境壓力的損害，協(xié)助蛋白的修復，參與溶酶體對N端封閉蛋白的降解等[34]。GOULART-SILVA等[35]對INS-1E細胞(胰腺β細胞)施以甲狀腺素T3處理后，翻譯因子EF1A和胰島素的表達同時增長。

進一步對編碼它們的基因mRNA表達分析結果顯示，它們的表達在外源甲狀腺素處理后均表現(xiàn)出顯著變化，其中beta-F1-ATPase、Hsp90β、Cct6A、RPS15A、Slc25a5和EF1a的表達受外源甲狀腺素處理顯著下調，CK1截然相反，它的表達受甲狀腺素處理顯著上調；硫脲的處理對所分析的基因則幾乎都沒有明顯影響(圖5)。這些結果間接支持了所分析的可信蛋白與甲狀腺素受體β之間的相互聯(lián)系。本文對牙鲆甲狀腺素受體β結合蛋白的研究還停留在描述性階段，它們與TRβ的準確關系和具體功能仍然需要進行下一步的更深研究。盡管如此，本文的研究結果將有助于牙鲆甲狀腺素受體結合蛋白與牙鲆變態(tài)關系的研究。