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(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

馬鈴薯所含營(yíng)養(yǎng)成分豐富,是世界上的第四大糧食作物。中國(guó)是全球第一大馬鈴薯生產(chǎn)國(guó),馬鈴薯產(chǎn)量及消費(fèi)面不斷擴(kuò)大,其種植面積也在相應(yīng)擴(kuò)增[1]。馬鈴薯在生長(zhǎng)和貯藏期都易受各種病菌的侵染而發(fā)生不同程度的腐爛,且腐爛極易擴(kuò)散,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。隨著我國(guó)馬鈴薯主食化戰(zhàn)略的提出,由馬鈴薯腐爛造成的經(jīng)濟(jì)損失進(jìn)一步引起人們的關(guān)注,對(duì)腐爛樣本進(jìn)行檢測(cè)并及時(shí)剔除,減少因感染而引起的大面積腐爛變得尤為重要。

現(xiàn)階段常用的馬鈴薯腐爛的無(wú)損檢測(cè)方法主要有機(jī)器視覺(jué)、近紅外、高光譜等檢測(cè)方法,與人工相比，無(wú)損檢測(cè)方法提高了檢測(cè)速度,但存在檢測(cè)指標(biāo)片面、數(shù)據(jù)處理復(fù)雜等不可忽略的缺點(diǎn)[3-4]。面對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法的局限性,能否建立一種快速的無(wú)損檢測(cè)方法,對(duì)由致病菌引起的馬鈴薯腐爛樣本進(jìn)行檢測(cè),及時(shí)剔除腐爛潛伏期、早期和中期的樣本,減少因感染而引起的大面積腐爛已成為影響農(nóng)民增收的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

真菌侵染后的樣本隨時(shí)間的延長(zhǎng)其菌種含量逐漸增多,菌種活性不斷增強(qiáng),所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的量也不斷增加,進(jìn)而導(dǎo)致樣本所釋放的氣體種類及強(qiáng)度不斷變化。因此本文提出采用電子鼻技術(shù)對(duì)真菌性腐爛病進(jìn)行快速檢測(cè)。電子鼻是一種由氣敏傳感器陣列和適當(dāng)?shù)哪Ｊ阶R(shí)別方法組成的智能氣味檢測(cè)設(shè)備,主要用來(lái)檢測(cè)、分析以及辨別樣本的整體氣味信息。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者M(jìn)assimo F Rutolo、E Biond、朱娜、蔣雪松等[5-8]也探索了電子鼻在檢測(cè)馬鈴薯、草莓腐爛和食品微生物污染中的可行性,均取得了較理想的效果。由真菌導(dǎo)致的馬鈴薯腐爛病早期樣本外部無(wú)明顯變化,因此不能直接得到檢測(cè)樣本,有關(guān)馬鈴薯腐爛病檢測(cè)方法研究的現(xiàn)有報(bào)道中,均需通過(guò)侵染實(shí)驗(yàn)制備得到各階段樣本,且所用菌種多通過(guò)直接購(gòu)買得到,但不同地區(qū)馬鈴薯主要致腐菌各不相同,因此對(duì)實(shí)際應(yīng)用指導(dǎo)性不強(qiáng)。本文首先從自然存放過(guò)程中腐爛的馬鈴薯中分離鑒定出主要致腐菌,以此菌種為病原菌進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn),制備得到馬鈴薯腐爛樣本,用于電子鼻檢測(cè)。使用電子鼻技術(shù)與模式識(shí)別算法相結(jié)合,對(duì)侵染不同階段的樣本進(jìn)行判別,以期為馬鈴薯早期腐爛檢測(cè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

馬鈴薯 鎮(zhèn)江農(nóng)戶,將樣本室溫下存放待用;菌株M-5 分離于存放過(guò)程中自然腐敗的馬鈴薯,經(jīng)純化后低溫保存于本實(shí)驗(yàn)室;馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA,g/L) 馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂粉20,蒸餾水1000 mL,pH自然;DNA抽取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑、核酸提取所需試劑、DNA Marker 上海生工。

電子鼻 圖1,由江蘇大學(xué)食品、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)無(wú)損檢測(cè)技術(shù)研究中心自主研制;恒溫恒濕箱SPX系列 上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;生物顯微鏡(MR-2000) 江南光學(xué)儀器廠;電泳儀(DYY-12型) 北京六一公司;ABI基因擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司;GR85DR型全自動(dòng)高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司。

圖1 電子鼻系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖 Fig.1 The schematic diagram of electronic nose system注:1:集氣室,2:待測(cè)樣本,3:泵,4:反應(yīng)氣室,5:傳感器,6:電磁閥a,7:氣路管路,8:電磁閥b,9:氧氣罐,10:計(jì)算機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化與篩選 采用組織分離法分離菌種:在無(wú)菌操作臺(tái)上,將存放過(guò)程中自然腐爛的馬鈴薯用75%酒精進(jìn)行表面消毒,用滅菌后的藥匙挖取適量腐爛組織,放入裝有10 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中,制備成10-1的果肉稀釋液。振蕩混勻后將液體逐級(jí)梯度稀釋至10-8。分別選取10-5、10-6、10-7、10-8四個(gè)稀釋梯度,取適量懸濁液涂布,置于25 ℃恒溫恒濕箱內(nèi)培養(yǎng)。經(jīng)多次純化后獲得單菌落平板,4 ℃存放備用。

將分離純化得到單菌落接種至正常馬鈴薯中,每株菌種感染20個(gè)正常樣本,持續(xù)2個(gè)月觀察感染樣本的腐爛狀況,依據(jù)腐爛結(jié)果篩選出致腐爛菌,用于后期腐爛樣本的制備。

1.2.2 致腐菌分子鑒定 篩選得到的致腐菌進(jìn)行分子鑒定,確定其菌體菌種。具體操作如下:

DNA提取:采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽取試劑盒進(jìn)行DNA提取,略作修改。

PCR擴(kuò)增體系25 μL:加入12.5 μL supermix酶、ITS1和ITS4引物各加入1 μL,2 μL樣品和8.5 μL的超純水。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min;循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證是否獲得目的片段。確定獲得目的片段后將其送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.2.3 腐爛樣本制備 以鑒定得到的馬鈴薯主要致腐菌為病原菌,采用整薯刺傷接種法[9]制備得到腐爛樣本。具體操作如下:選取完好整薯120個(gè),大小適中,經(jīng)消毒預(yù)處理后進(jìn)行打孔接菌。用滅菌后的打孔器在每個(gè)整薯上打4個(gè)孔,4個(gè)孔沿縱軸方向均布,每個(gè)孔垂直于縱軸。將培養(yǎng)好的致腐菌A.pullulans的單菌落刮至裝有5 mL生理鹽水的試管中,制備成菌懸液。用移液器吸適量菌懸液注射至孔內(nèi),每個(gè)整薯沿縱軸方向連續(xù)接種3個(gè)點(diǎn),最后一個(gè)點(diǎn)接相同體積的無(wú)菌水做為對(duì)照。經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)測(cè),接種菌濃度為2×108CFU/mL,樣本接菌后在28 ℃,95% RH的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)。制備得到的馬鈴薯被分為三個(gè)階段,且每階段樣本數(shù)為30個(gè)。第一階段潛伏期,接種5 d后外部并無(wú)異樣;第二階段感染早期,接種18 d后樣本外部可觀察到霉菌絲;第三階段感染中期,接種35 d后樣本外部開(kāi)始腐爛。

所有階段樣本先采用電子鼻進(jìn)行測(cè)定,然后將薯塊沿縱軸切開(kāi),測(cè)量腐爛斑的最大直徑,求出平均值。

1.2.4 電子鼻測(cè)定 采用圖1所示電子鼻進(jìn)行檢測(cè),傳感器陣列主要由TGS832、WSP2110、TGS822、TGS813、TGS880、TGS2610、TGS2611、TGS2620組成。將侵染制備得到的馬鈴薯腐爛樣本分別放入800 mL圓柱形無(wú)味玻璃容器中進(jìn)行集氣,集氣時(shí)間為40 min,從而獲得頂空氣體;電子鼻預(yù)熱3 h,每次電子鼻檢測(cè)開(kāi)始前,使用氧氣對(duì)電子鼻系統(tǒng)進(jìn)行還原,還原完成后,電子鼻抽取密閉容器中的頂空氣體,對(duì)馬鈴薯樣品進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)過(guò)程中按照1次/s的速率記錄傳感器響應(yīng)信號(hào),共采集420個(gè)信號(hào)值;120個(gè)樣本依次進(jìn)行測(cè)定,從而得到傳感器陣列對(duì)不同檢測(cè)樣品的響應(yīng)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

獲得菌株序列后,通過(guò)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)分析。然后運(yùn)用DNAStar軟件,生成系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行同源性及聚類分析。

電子鼻測(cè)定得到的信號(hào)曲線趨于穩(wěn)定時(shí),表明樣本氣體已與傳感器充分反應(yīng),因此選用穩(wěn)定值的平均值作為特征變量進(jìn)行建模。從120個(gè)測(cè)定樣本中隨機(jī)選取80個(gè)樣本作為訓(xùn)練集,40個(gè)樣本作為預(yù)測(cè)集,分別建立K最近鄰和BP-神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)判別模型,對(duì)接菌后不同階段的馬鈴薯進(jìn)行判別,所有數(shù)據(jù)分析均在MATLAB 2010.b軟件上實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 致腐爛菌種的鑒定

分離純化后共得到5株菌株,2個(gè)月后各菌株感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:接種菌種1與菌種3的樣本無(wú)明顯變化,樣本切開(kāi)后孔徑內(nèi)壁已干結(jié)并無(wú)腐爛現(xiàn)象;接種菌種4的樣本外部有黃綠色霉斑,切開(kāi)后孔徑內(nèi)為黃綠色斑點(diǎn)但并未腐爛;接種菌種5的樣本初期外部有黑色菌絲生長(zhǎng),后期外部開(kāi)始腐爛,切開(kāi)樣本后內(nèi)部均發(fā)生不同程度的腐爛。依據(jù)致腐爛性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定出菌種5(M-5)為馬鈴薯主要致腐菌,其菌落形態(tài)如圖2所示。

圖2 菌種M-5菌落圖Fig.2 Bacterial M-5 colony map

菌株M-5的ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物與蛋白Marker擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖3所示,對(duì)比后確定此菌株ITS區(qū)長(zhǎng)度約600 bp?；厥誅NA片段并測(cè)序,得到菌株的ITS序列。對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定(圖4),將序列在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行同源性比較(BLAST),并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖5所示。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹匹配后M-5菌種與Aureobasidiumpullulans同源性為100%,結(jié)合形態(tài)觀察,最終鑒定菌株5為出芽短梗霉菌A.pullulans。經(jīng)查,果蔬微生物生態(tài)學(xué)研究中有關(guān)于A.pullulans分離株的報(bào)道[10],但關(guān)于出芽短梗霉在馬鈴薯腐爛樣本中的報(bào)道還未發(fā)現(xiàn)。

圖4 M-5菌株ITS區(qū)序列Fig.4 ITS sequence of A.pullulans

圖5 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree based on ITS sequence

圖3 ITS區(qū)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of ITS PCR products注:Marker為蛋白標(biāo)準(zhǔn)物,M-5為待測(cè)菌株5。

2.2 不同腐爛階段的馬鈴薯樣本識(shí)別

經(jīng)電子鼻測(cè)定后,采集得到侵染后各腐爛階段馬鈴薯樣本的氣味信息值,如圖6中(a)和(b)分別為腐爛潛伏期與腐爛中期樣本響應(yīng)曲線。由圖6可知，當(dāng)采集值370 s時(shí)樣本值已達(dá)到穩(wěn)定,因此提取380～400 s的平均值作為馬鈴薯品質(zhì)判別的特征值,建立馬鈴薯腐爛階段判別模型。

圖6 樣本傳感器響應(yīng)曲線Fig.6 Response curve of electronic nose

2.2.1 馬鈴薯腐爛階段的K最近鄰法判別分析 對(duì)腐爛潛伏期、早期和中期三個(gè)階段樣本的內(nèi)部腐爛直徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì),分別為(3.55±0.6)、(5.48±1.05)、(7.22±2.1) mm。建模時(shí),考慮了不同主成分?jǐn)?shù)和最近鄰樣本個(gè)數(shù)對(duì)模型的影響,采用留一法交互驗(yàn)證的方式對(duì)這兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,得到性能最佳模型,結(jié)果如圖7所示,當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為6,K值為4時(shí)模型判別效果最優(yōu),其中訓(xùn)練集的識(shí)別率為90%,預(yù)測(cè)集識(shí)別率為85%。模型中正常樣本與侵染樣本被完全區(qū)分開(kāi),誤判主要發(fā)生在潛伏期與早期之間,共有5個(gè)潛伏期樣本被誤判為早期。主要原因是侵染后這些樣本中菌種橫向生長(zhǎng),故雖外部未有異樣,但內(nèi)部腐爛直徑接近5.5 mm,樣本氣體強(qiáng)度與感染早期樣本相近,因此誤判。共有1個(gè)腐爛早期樣本被誤判為潛伏期,主要是接種后菌種縱向生長(zhǎng),樣本孔徑外部雖有菌絲長(zhǎng)出,但內(nèi)部腐爛程度不足4 mm,氣體強(qiáng)度較弱。

圖7 KNN模型訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的識(shí)別能力Fig.7 Discrimination rates of training set and prediction set by KNN model

2.2.2 馬鈴薯腐爛階段的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)判別分析 誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Back propagation artificial neuron network,BP-ANN)是一種反向傳遞并修正誤差的多層映射神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),一般用來(lái)處理非線性的分類問(wèn)題、兩個(gè)相關(guān)數(shù)據(jù)矩陣間復(fù)雜的非線性模型關(guān)系[11-12]。模型參數(shù)設(shè)置如下:隱含層數(shù)為12,最大迭代次數(shù)1000,學(xué)習(xí)速率0.1,動(dòng)量因子0.7,訓(xùn)練目標(biāo)為誤差≤10-8。模型結(jié)果如表1所示,樣本訓(xùn)練集的正確率為93.75%,測(cè)試集的正確率為90.00%,預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率相比KNN模型提高了5%。表1顯示，誤判主要發(fā)生在腐爛中期,主要原因是此三個(gè)樣本雖外部腐爛直徑較大,但其腐爛深度較淺,因此氣味信息較淡,被誤判為腐爛潛伏期與早期。所建的BP-ANN模型將正常樣本與腐爛各階段樣本進(jìn)行較好區(qū)分,潛伏期樣本與早期樣本之間不再重疊。此結(jié)果表明,利用電子鼻技術(shù)與BPANN判別模型相結(jié)合,不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腐爛早期樣本的識(shí)別，還可以對(duì)侵染后各階段樣本進(jìn)行較精確的區(qū)分,及時(shí)將侵染樣本與正常樣本進(jìn)行區(qū)分,避免因感染而導(dǎo)致的不必要損失,為后期電子鼻技術(shù)應(yīng)用至馬鈴薯腐爛早期檢測(cè)提供理論依據(jù)。

表1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)判別結(jié)果Table 1 Discrimination results of BP-ANN

3 結(jié)論

本研究從存放過(guò)程中自然腐爛的馬鈴薯中分離、純化并鑒定出馬鈴薯致腐爛菌種,將鑒定出來(lái)的主要致病菌對(duì)樣本進(jìn)行侵染;采用電子鼻技術(shù)對(duì)浸染后不同階段的腐爛樣本進(jìn)行檢測(cè),探討了電子鼻對(duì)馬鈴薯腐爛早期識(shí)別的可行性。依據(jù)常帆等人的研究可知，出芽短梗霉代謝產(chǎn)物中有較多的淀粉酶和果膠酶[13]。此菌在馬鈴薯樣本中寄存生長(zhǎng)后將導(dǎo)致樣本內(nèi)部組織分解,進(jìn)而腐爛。本實(shí)驗(yàn)表明，出芽短梗霉在一定環(huán)境條件下,作為馬鈴薯致腐爛的主要菌種,導(dǎo)致大量的經(jīng)濟(jì)損失。馬鈴薯在致病菌的作用下不斷腐爛,腐爛不同階段產(chǎn)生的氣體成分種類和含量會(huì)有所不同,采用電子鼻技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。建立KNN線性判別模型后訓(xùn)練集識(shí)別率為90%,預(yù)測(cè)集識(shí)別率為85%,可見(jiàn)電子鼻對(duì)侵染后樣本檢測(cè)是有效的。采用BP-ANN模型對(duì)不同腐爛階段的馬鈴薯樣本進(jìn)行判別,其模型識(shí)別率訓(xùn)練集為93.75%,預(yù)測(cè)集為90.00%,所建BPANN模型不僅可以將正常樣本與腐爛樣本進(jìn)行區(qū)分,還對(duì)腐爛各階段進(jìn)行了較好的識(shí)別。此結(jié)果表明了將電子鼻應(yīng)用于馬鈴薯早期腐爛檢測(cè)的可行性,為后期電子鼻在馬鈴薯檢測(cè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。