張 何,趙智糧,傅 昕,王 青

(湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,湖南 湘潭 411104)

汞是一種高毒性重金屬元素,可在水、空氣和土壤中進(jìn)行遷移,并通過食物鏈進(jìn)入人體。近幾年發(fā)現(xiàn)如果長期接觸Hg2+,可直接引起腦損傷、運(yùn)動障礙、致畸、致癌和腎衰竭等疾病[1-2]。因此在防治汞污染的同時(shí),快速、高效地檢測Hg2+技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前比較成熟的汞檢測技術(shù)包括原子熒光光譜法,電化學(xué)法、冷原子吸收法、熒光光譜法等儀器方法[3-5],這些方法具有較好的特異性,準(zhǔn)確性以及靈敏度,但是該類技術(shù)依靠大型儀器,費(fèi)用昂貴,不宜進(jìn)行現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測。利用生物傳感器[6-7]檢測Hg2+,主要根據(jù)胸腺嘧啶(T)特異性識別Hg2+,形成特殊的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)[8-10]。Ono A等首次報(bào)道了利用DNA作為Hg2+的識別元件,在液相體系中高特異檢測Hg2+的新思路[11]。

DNA 酶(DNAzyme)是一種具有催化性能的DNA分子,因其易于復(fù)制和儲存、價(jià)格低廉、便于特殊標(biāo)記和操作、不易水解且熱穩(wěn)定性良好等優(yōu)勢,使其在生物模擬酶的研究中占據(jù)極其重要的地位[12-13]。G-四鏈體-Hemin DNA 酶則是近些年來迅速發(fā)展起來的一種DNA酶[14-19],G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基(G)的DNA 序列形成的一種特殊的DNA二級結(jié)構(gòu)[20-21],當(dāng)它們與氯化血紅素(Hemin)結(jié)合后,可以顯現(xiàn)出較強(qiáng)的過氧化物酶活性,能夠催化H2O2參與的一些反應(yīng)[22-25]。目前,G-四鏈體-氯血紅素DNA 酶用于檢測的優(yōu)勢得到了進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)和鞏固,發(fā)展了多種生物傳感器[26-29]。近年來,將G-四鏈體-氯血紅素DNA 酶酶促信號放大與T-Hg2+-T特異性識別結(jié)合起來,發(fā)展了多種Hg2+檢測新方法[30-32],雖然這類傳感器彌補(bǔ)了傳統(tǒng)儀器分析方法的不足,但仍然存在信號放大方法單一、靈敏度不足等問題,在生物醫(yī)學(xué)樣品分析方面難以實(shí)現(xiàn)超靈敏Hg2+檢測。

目前廣泛用于提高生物傳感器靈敏度的核酸分子擴(kuò)增技術(shù)主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、鏈置換擴(kuò)增、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等[33-35],但這些技術(shù)依賴于DNA模板擴(kuò)增,而擴(kuò)增的模板序列增加了交叉污染的可能性,因此該類方法容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是2個DNA發(fā)夾之間的自組裝雜交反應(yīng),在引發(fā)DNA存在時(shí),通過部分互補(bǔ)序列重疊成一個長的雙鏈DNA納米線(納米線定義為一種具有在橫向上被限制在100納米以下(縱向沒有限制)的一維結(jié)構(gòu),DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的直徑為2 nm)。由于不需要擴(kuò)增DNA模板、信號放大不需要酶參與、假陽性率低等特點(diǎn),該方法已經(jīng)與多種技術(shù)相結(jié)合用于發(fā)展新型、高效生物傳感器,如電化學(xué)方法測定核酸[36]、生物發(fā)光方法測定核酸[37]、熒光方法測定核酸[38]、G-四鏈體-血紅素DNA酶納米線測定核酸[27]、G-四鏈體-血紅素DNA酶納米線測定脂多糖[39]等技術(shù),而且雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)還可以進(jìn)一步應(yīng)用于分子生物學(xué)、DNA診斷和臨床診斷。

本研究以聚苯乙烯微球?yàn)榧{米線自組裝界面,通過T-Hg2+-T特異性識別結(jié)構(gòu)引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng),在微球界面上自行組裝具有串聯(lián)排列分子間裂分 G-四鏈體-血紅素DNA酶的DNA納米線,發(fā)展高靈敏的Hg2+“Turn on”檢測生物傳感器。該技術(shù)具有檢測靈敏度高,特異性好的特點(diǎn),操作簡單,可用于現(xiàn)場檢測技術(shù)的發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津儀器公司),手提式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐區(qū)醫(yī)療器械有限公司),真空干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司),電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司),高速離心機(jī)(艾本德生命科學(xué)公司),超純水器(德國默克密理博公司),pH酸度計(jì)(杭州陸恒生物科技有限公司)。鏈霉親和素功能化的聚苯乙烯微球(直徑15.4 μm)購自美國Bangs Lab公司,氯化血紅素(Hemin)、2,2′-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二甲亞砜(DMSO)、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、HgCl2、Pb(NO)2、CdCl2、FeCl2及其他金屬離子均購自上海生工生物工程股份有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司。DNA探針(表1)購自上海生工生物工程股份有限公司,并經(jīng)HPLC純化。

表1 DNA探針序列

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 微球修飾

取100 μL鏈霉親和素修飾的微球(直徑為15.4 μm)于0.5 mL的滅菌離心管中,用100 μL的親和洗脫液(pH 7.5,20 mmol/L Tris-HCl,1 M NaCl,1 mmol/L EDTA,0.0005% Triton X-100)洗滌兩次,3 500 r/min離心分離后去上層清液。向微球中加入47 μL的親和洗脫液以及3 μL的Hg2+捕獲探針(10μM),混合均勻并37 ℃搖床孵育1 h。通過離心洗滌除去未結(jié)合的探針,加入100 μL親和洗脫液于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 汞離子比色分析

發(fā)夾探針P1和發(fā)夾探針P2分別加熱到95 ℃孵育,5 min后再緩慢(2 h內(nèi))冷卻到室溫以保證發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成,使用前保存在4 ℃。移取5 μL功能化微球于滅菌離心管中,加入10 μL發(fā)夾探針P1和發(fā)夾探針P2的混合溶液(0.5 μmol/L),10 μL不同濃度的Hg2+,再加入160 μL 10 mmol/L HEPES buffer(pH 7.0,包含100 mmol/L NaNO3,25 mmol/L KNO3),37 ℃搖床孵育50 min。離心去上清,用HEPES buffer洗滌3次,最后加入100μL的HEPES buffer重新懸浮。加入6 μL 20 μM的hemin,避光下37 ℃孵育20 min,離心并用10 mmol/L HEPES buffer洗滌3次,除去多余的hemin。最后加入50 μL ABTS(4 mmol/L),和50 μL H2O2(4 mmol/L),在37 ℃條件下反應(yīng)8 min,之后離心分離,取上層清液,進(jìn)行吸收檢測。我們選擇420 nm處的吸光度作為測量值,定義ΔA420 nm=A420 nm-A0,其中A420 nm為樣品測量值,A0為Hg2+濃度為0時(shí)的背景值。

圖1 自組裝串聯(lián)DNA酶納米線傳感器檢測Hg2+原理圖

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

本研究借助分子間裂分G-四鏈體DNA酶的催化特性,在微球上構(gòu)建一種檢測Hg2+的信號放大方法。首先在微球表面修飾富含T堿基的Hg2+捕獲探針,其5′端帶有生物素標(biāo)記和C10延長鏈,通過生物素和鏈霉親和素的特異性結(jié)合,固定到鏈霉親和素修飾的微球表面。G-四鏈體的形成至少需要4組連續(xù)或相互靠近的GGG序列,發(fā)夾探針P1和發(fā)夾探針P2的序列一端都含有3組GGG重復(fù)序列,另一端含有一組GGG重復(fù)序列,但由于2個探針在形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)一組GGG被包含在莖部區(qū)域,因此不能形成分子內(nèi)G-四鏈體。檢測原理如圖1所示,在發(fā)夾探針P1、發(fā)夾探針P2及Hg2+存在時(shí),Hg2+捕獲探針與發(fā)夾探針P1的3′端序列雜交并形成4個T-Hg2+-T結(jié)構(gòu),并將發(fā)夾探針P1的莖部打開釋放P1的5′端。發(fā)夾探針P1釋放的5′端序列與發(fā)夾探針P2的5′端序列反向完全互補(bǔ)并打開發(fā)夾探針P2的莖部結(jié)構(gòu),發(fā)夾探針P2釋放的3′端序列與發(fā)夾探針P1的3′端序列完全互補(bǔ)并打開發(fā)夾探針P1的莖部結(jié)構(gòu),釋放其5′端序列,如此周而復(fù)始,在微球表面形成DNA納米線。由于發(fā)夾探針P1、發(fā)夾探針P2的5′游離末端及3′游離末端都包含富G序列,而且在組裝的納米線上通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相互拉近并折疊形成分子間裂分G-四鏈體,構(gòu)建成含有串聯(lián)排列DNA酶的DNA納米線。在Hemin插入后顯示出明顯增強(qiáng)的類過氧化物酶的催化活性,該酶能催化H2O2與2,2′-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)之間的反應(yīng)產(chǎn)生綠色的陽離子自由基ABTS·+,在420 nm處存在最大吸收峰,其吸光值與反應(yīng)體系中汞離子濃度的存在定量關(guān)系。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為獲得優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,考察了功能化微球的使用量、Hemin濃度、修飾在微球上的Hg2+捕獲探針與發(fā)夾探針P1通過T-Hg2+-T配位結(jié)合的時(shí)間和溫度對Hg2+檢測的影響。

2.2.1 微球用量的選擇

微球?yàn)楣x子識別、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及DNA酶催化反應(yīng)提供了反應(yīng)平臺,探針功能化的微球用量決定反應(yīng)體系的靈敏度。如圖2(a)所示,加入反應(yīng)體系的微球的量在5μL(5.06×103beads/μL)以下時(shí),隨著微球量的增加,吸光值也相應(yīng)提升,表明在此范圍內(nèi)微球量的增加,捕獲的汞離子量也增加,形成了更多的DNA酶分子;當(dāng)反應(yīng)體系中微球的量大于5 μL的時(shí)候,吸光度不再隨微球的量增加而增加,說明體系中微球的量已達(dá)到飽和。由此可見,該檢測體系中微球的最適用量為5 μL,即25.3×103beads為最合適的加入量。

2.2.2 Hemin濃度的選擇

向形成串聯(lián)排列G-四鏈體DNA納米線溶液中加入Hemin后,Hemin會插入G-四鏈體形成具有過氧化物酶活性的G-四鏈體-氯血紅素-DNA酶,但由于游離的Hemin也具有一定的過氧化物酶催化活性,所以Hemin的濃度可能會對傳感器的靈敏度產(chǎn)生影響。結(jié)果如圖2(b)所示,Hemin的最佳濃度為20 μmol/L。當(dāng)Hemin的濃度在20 μmol/L以下時(shí),信號值(ΔA420 nm)隨著Hemin濃度的增加而增加;當(dāng)Hemin的濃度過高時(shí),其背景信號也相應(yīng)增強(qiáng),所以信號值反而隨之下降。因此反應(yīng)體系中Hemin的最佳濃度為20 μmol/L。

圖2 Hg2+濃度響應(yīng)信號(ΔA420 nm)影響因素的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

2.2.3 Hg2+捕獲時(shí)間和溫度的選擇

修飾在微球上的Hg2+捕獲探針包含多個T堿基,需要Hg2+參與配位與發(fā)夾探針P1的富T序列結(jié)合,其結(jié)合效率直接影響檢測的靈敏度?？疾炝薍g2+捕獲時(shí)間為10 min～80 min時(shí)對檢測性能的影響,結(jié)果如圖2(c)所示,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從10 min增加到50 min時(shí),反應(yīng)體系的ΔA420 nm增加,說明隨著時(shí)間的延長,G-四鏈體DNA酶的組裝量增加,催化性能增強(qiáng),反應(yīng)時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)體系的ΔA420 nm達(dá)到最大,隨后并不隨著時(shí)間的延長而增加,說明此時(shí)Hg2+的捕獲趨于飽和,所以選擇50 min作為Hg2+的捕獲時(shí)間。對Hg2+捕獲的最適溫度進(jìn)行了考察,選擇的溫度范圍為:5 ℃～45 ℃,結(jié)果如圖2(d)所示,隨著反應(yīng)溫度的升高,反應(yīng)體系ΔA420 nm相應(yīng)增加,在37 ℃時(shí)達(dá)到最高,隨后隨著溫度的升高,信號值開始下降。

圖3 Hg2+檢測的選擇性分析

2.3 Hg2+的選擇性分析

為檢測傳感體系對Hg2+檢測的選擇性,實(shí)驗(yàn)選擇了9種常見的金屬離子(Zn2+、Pb2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+、Cd2+、Ca2+、Mn2+、Co2+)作為共存離子,并分別檢驗(yàn)了它們對Hg2+檢測的干擾程度。結(jié)果如圖3所示,在最優(yōu)條件下反應(yīng),未加任何離子的反應(yīng)體系(空白對照)吸光值與分別加入不同干擾離子的反應(yīng)體系吸光值相差不大(柱狀圖灰色表示),表明該生物傳感器對以上9種離子并不體現(xiàn)出選擇性;另外Hg2+與其他金屬離子共存時(shí)(共存離子的濃度與汞離子的濃度之比為100∶1),向反應(yīng)體系中同時(shí)加入1 nmol/L的汞離子和上述100 nmol/L其他金屬共存離子,空白對照中只加入1 nmol/L的汞離子,發(fā)現(xiàn)各組吸光值與空白對照吸光值相差不大(柱狀圖白色表示),相對誤差在-2.8%～1.7%之間,結(jié)果表明以上9中金屬離子對汞離子的干擾性很小。同時(shí),通過空白組也可看出,設(shè)計(jì)的生物傳感器對汞離子具有高選擇性。

圖4 (a)Hg2+濃度在2 pmol/L～10 nmol/L范圍內(nèi)的 校正曲線;(b)檢測Hg2+的線性范圍

2.4 Hg2+的定量檢測

與其他汞離子分析方法相比較,如:基于金納米顆粒修飾的絲網(wǎng)印刷電極免標(biāo)記檢測尿液中汞離子(檢出限2 500 pmol/L)[40]、電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測尿液和血液中汞離子(檢出限847 pmol/L)[41]、基于DNAzyme/ABTS-H2O2體系的尿液中Hg2+比色傳感器(檢出限2 000 pmol/L)[32]、基于核酸外切酶I輔助的尿液中Hg2+熒光傳感器(檢出限1 500 pmol/L)[42],本方法檢測尿液中汞離子(檢出限1.5 pmol/L),具有較高檢測靈敏度。這主要?dú)w因于三重信號提升方式:微球反應(yīng)界面導(dǎo)致減少的背景干擾及信號提高、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成串聯(lián)排列分子間裂分G-四鏈體-血紅素DNA酶的DNA納米線以及 G-四鏈體-血紅素DNA酶的酶促催化信號放大。

2.5 實(shí)際樣品分析

為考察該方法用于實(shí)際樣品中Hg2+檢測的性能,人體尿液為檢測對象構(gòu)建檢測體系。實(shí)驗(yàn)采用加標(biāo)法,向離心管中加入4 μL的本底尿液,然后加入不同濃度的汞離子溶液,反應(yīng)溶液中的汞離子濃度分別為15 pmol/L、20 pmol/L、50 pmol/L。結(jié)果如表2所示,檢測尿液樣品的平均回收率為97.6%～103.7%之間,RSD在1.7%～3.1%之間;說明設(shè)計(jì)的傳感器可用于尿液樣本中的汞離子檢測,具有較好的準(zhǔn)確度。

表2 實(shí)際樣品檢測

3 結(jié)論

本研究以聚苯乙烯微球?yàn)榧{米線組裝界面,通過T-Hg2+-T特異性識別結(jié)構(gòu)引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng),在微球界面上自行組裝具有串聯(lián)排列分子間裂分G-四鏈體-血紅素DNA酶的DNA納米線,發(fā)展了一種高靈敏的Hg2+“Turn on”檢測生物傳感器。微球的引入極大的增強(qiáng)了傳感器的抗干擾能力,降低了背景信號,實(shí)現(xiàn)了人體尿液中Hg2+的快速檢測。本方法操作簡單、靈敏度高、特異性好,適合發(fā)展為環(huán)境監(jiān)測現(xiàn)場實(shí)時(shí)分析技術(shù),未來亦可能成為醫(yī)學(xué)界檢測汞離子的手段。