張 丹，王允野

(吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 132013)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率長期居于惡性腫瘤第4位，死亡率居消化道惡性腫瘤第1位[1]。胃癌的發(fā)生發(fā)展由多個系統(tǒng)共同調(diào)控，其中免疫學(xué)調(diào)控與其關(guān)系密切[2]。胃癌的免疫學(xué)療法是除手術(shù)切除、放化療外的重要輔助治療手段之一，通過特異性或非特異性免疫療法激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌作為益生菌，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等多種作用[3]。已有研究證實(shí)，干酪乳桿菌可通過調(diào)節(jié)外周血免疫球蛋白及淋巴細(xì)胞生成，激活機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫，進(jìn)而抑制肝癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[4-5]。但目前關(guān)于干酪乳桿菌對胃癌的抑制作用報道較少。鑒于此，本研究特設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)，觀察干酪乳桿菌對胃癌大鼠腫瘤生長狀況及免疫功能的影響，并探討其免疫學(xué)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠50只，5周齡，體重140～150 g，購于上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部[SCXK(滬)2014-0004]，大鼠飼養(yǎng)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(吉)2016-0001]，動物實(shí)驗(yàn)倫理審批號IACUC 20161022003。動物實(shí)驗(yàn)過程中遵循實(shí)驗(yàn)動物3R原則。

1.1.2 菌株

Lactobacilluscasei干酪乳桿菌，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號：CICC20282。

1.2 主要試劑與儀器

N-甲基-N-硝基-亞硝基胍(MNNG，F(xiàn)luka公司，批號20160310)，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(賽默飛公司，批號NVE0268)，人外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，Solarbio公司，批號P8900-200)，抗大鼠異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC，批號：20140526)-CD3+/藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)-CD4+(批號：20150311)、FITC-CD3+/PE-CD8+雙標(biāo)抗體及FITC-CD11b/c+(批號：20140738)(Biolegend公司)，鼠抗兔Toll樣受體4(TLR4，批號：20150814)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB，批號：20150201)p65(一抗，批號：20151108)，羊抗鼠TLR4(批號：20150625)、NF-κB p65(批號：20150837)(二抗)(Abcam公司)；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，OmniPAGEMaxi Plus 電泳儀(Cleaver公司)，SM2010R徠卡切片機(jī)(Leica公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型構(gòu)建及分組

50只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，簡單隨機(jī)化法分為5組：對照組、模型組、干酪乳桿菌低、中、高劑量組，每組10只。模型組及3劑量組大鼠給予MNNG濃度為100 μg/mL的飲用水(酒精助溶，使用前配置，飲水瓶避光放置)，持續(xù)給予28周，建立大鼠胃癌模型，之后改為正常飲用水；對照組給予酒精水溶液，28周后換用正常飲用水。3個劑量組分別灌胃給予4、8、12 mL/kg干酪乳酸菌，模型組和對照組灌胃給予10 mL/kg無菌蒸餾水，每天1次，持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)過程中若大鼠死亡，則自動補(bǔ)充同期飼養(yǎng)及同步干預(yù)的大鼠入組。

1.3.2 病理組織學(xué)觀察

末次灌胃6 h后，引頸處死大鼠，取胃部放入4%中性甲醛固定(確保胃內(nèi)外充滿甲醛固定液)，組織修剪后，酒精梯度脫水然后用石蠟包埋，制作石蠟切片。經(jīng)脫蠟、水化后，采用常規(guī)蘇木精-伊紅染色法(HE)進(jìn)行染色，并用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.3 胸腺指數(shù)、脾指數(shù)

末次灌胃6 h后，引頸處死大鼠，剝離完整的胸腺和脾臟組織，稱重。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.3.4 外周血和腫瘤組織中自然殺傷性細(xì)胞(natural killer cell，NK)細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群水平檢測

末次灌胃6 h后，取大鼠腹腔靜脈血1 mL，肝素抗凝后放入測試管。取新鮮胃癌組織1.0 g放入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，隨即研磨制成單細(xì)胞懸液，然后采用淋巴細(xì)胞分離液密度離心法制備淋巴細(xì)胞懸液，按照1∶3體積比加入10%福爾馬林PBS溶液保存，分別加入抗TCRαβ+-FITC/抗CD161a+-PE、抗CD3+-FITC/抗CD4+-PE、抗CD3+-FITC/抗CD8+-PE，對照組設(shè)立單染對照，嚴(yán)格根據(jù)說明書步驟操作，采用雙色流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞活性(TCRαβ+CD161a+)及T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+及CD4+/CD8+。

1.3.5 胃癌組織中TLR-4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量檢測

取大鼠新鮮胃癌組織，采用蛋白提取試劑盒步驟檢測總蛋白并進(jìn)行蛋白定量。每孔上樣15 μg，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離，4℃電轉(zhuǎn)90 min轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入按比例稀釋的一抗孵育2 h(室溫)，吸出1抗后加入二抗(1∶10 000)，常溫孵育1 h，重復(fù)洗滌后在暗室中曝光和顯影，待膠片晾干后掃描拍照，采用gle pro 4.0圖像分析工具進(jìn)行分析，以TLR-4、NF-κB蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)觀察

對照組前胃和腺胃黏膜下層無炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞層次明顯、排列整齊；模型組前胃和腺胃黏膜下層可見炎性細(xì)胞浸潤，鱗狀上皮細(xì)胞角化明顯，腺上皮細(xì)胞排列紊亂，呈現(xiàn)癌細(xì)胞；酪乳桿菌低、中、高劑量組前胃和腺胃黏膜下層炎性細(xì)胞減少，癌細(xì)胞數(shù)量減少，其中中劑量組減少最為明顯。結(jié)果見圖1。

2.2 胸腺指數(shù)、脾指數(shù)對比

與對照組相比模型組胸腺指數(shù)、脾指數(shù)顯著降低(P<0.01)，與模型組相比干酪乳桿菌低、中、高劑量組胸腺指數(shù)均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組相比干酪乳桿菌低、中、高劑量組脾指數(shù)均未見顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.3 外周血NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群對比

與對照組相比模型組外周血中TCRαβ+CD161a+、CD4+及CD4+/CD8+顯著減少(P<0.01)，與模型組相比干酪乳桿菌低、中、高劑量組外周血中TCRαβ+CD161a+、CD4+及CD4+/CD8+均顯著增加(P<0.01)。與對照組相比模型組外周血中CD8+顯著增加(P<0.01)，與模型組相比干酪乳桿菌低、中、高劑量組外周血中CD8+均顯著減少(P<0.01)。結(jié)果見圖2、表2。

2.4 腫瘤組織中NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群水平對比

與對照組相比模型組腫瘤組織中TCRαβ+CD161a+、CD8+顯著減少(P<0.01)，與模型組比較干酪乳桿菌低、中、高劑量組腫瘤組織中TCRαβ+CD161a+均顯著增加(P<0.05)。與模型組比較干酪乳桿菌低、中劑量組腫瘤組織中CD8+均顯著增加(P<0.05或P<0.01)。與對照組相比模型組腫瘤組織中CD4+、CD4+/CD8+顯著增加(P<0.05)，與模型組比較干酪乳桿菌低、中、高劑量組腫瘤組織中CD4+、CD4+/CD8+均顯著減少(P<0.05)。結(jié)果見表3。

2.5 腫瘤組織中TLR-4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量對比

與對照組相比模型組腫瘤組織中TLR-4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，與模型組比較干酪乳桿菌低、中、高劑量組腫瘤組織中TLR-4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見圖3、表4。

注：A～E為前胃，a～e為腺胃；A、a為對照組，B、b為模型組，C、c為低劑量組，D、d為中劑量組，E、e為高劑量組。圖1 前胃和腺胃粘膜病理切片(HE染色，×200)Note. A-E: Pregastric stomach. a-e: Gland stomach. A,a: Control group. B,b: Model group. C,c: Low dose group. D,d: Middle dose group. E,e: High dose group.Figure 1 Pathological changes of the mouse pregastric and glandular gastric mucosa (HE Staining)

組別Groups胸腺指數(shù)Thymus index脾指數(shù)Spleen index對照組Control group0.121±0.0130.360±0.046模型組Model group0.083±0.008b0.251±0.021b低劑量組Low dose group0.093±0.010c0.268±0.027中劑量組Middle dose group0.109±0.011d0.278±0.035高劑量組High dose group0.095±0.008c0.270±0.029F值F-Value21.35117.151P值P-Value<0.001<0.001

注：與對照組比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比，cP<0.05，dP<0.01，自由度(4,45)。

Note. Compared with the control group,aP<0.05,bP<0.01. Compared with the model group,cP<0.05,dP<0.01, df (4,45).

表2 外周血NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群對比Table 2 Comparison of peripheral blood NK cells and T lymphocyte subsets in the mice

注：與對照組比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比，cP<0.05，dP<0.01，自由度(4,45)。

Note. Compared with the control group,aP<0.05,bP<0.01. Compared with the model group,cP<0.05,dP<0.01, df (4,45).

表3 腫瘤組織中NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群水平對比Table 3 Comparison of NK cells and T lymphocyte subsets in tumor tissues of the mice

注：與對照組比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比，cP<0.05，dP<0.01，自由度(4,45)。

Note. Compared with the control group,aP<0.05,bP<0.01. Compared with the model group,cP<0.05,dP<0.01, df (4,45).

注：A：對照組，B模型組，C低劑量組，D中劑量組，E高劑量組。圖2 外周血中T淋巴細(xì)胞流式圖Note. A: Control group. B:Model group. C: Low dose group. D:Middle dose group. E: High dose group.Figure 2 Flow cytometric analysis of T lymphocytes in peripheral blood of the mice

圖3 蛋白免疫印跡圖Figure 3 Western blot of the protein experssions

3 討論

胃癌的病因及發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍未完全闡明，多種因素均可誘發(fā)胃癌[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[8]，機(jī)體的胃癌的發(fā)生與胃癌細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制有關(guān)，在正常生理狀態(tài)下，免疫細(xì)胞可對癌變細(xì)胞進(jìn)行及時清除，當(dāng)病理狀態(tài)下，機(jī)體免疫力下降，癌變細(xì)胞未引起免疫應(yīng)答，則易引發(fā)腫瘤。有學(xué)者認(rèn)為，在抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中，細(xì)胞免疫較體液免疫發(fā)揮更重要作用，當(dāng)機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量減少、活化功能障礙時，可導(dǎo)致免疫抑制，對胃癌患者的治療預(yù)后產(chǎn)生嚴(yán)重影響[9]。

表4 腫瘤組織中TLR-4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量對比Table 4 Comparison of relative protein expression of TLR-4 and NF-κB p65 in the tumor tissues

注：與對照組比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比，cP<0.05，dP<0.01，自由度(4,45)。

Note. Compared with the control group,aP<0.05,bP<0.01. Compared with the model group,cP<0.05,dP<0.01, df (4,45).

胸腺為機(jī)體的重要淋巴器官，是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場所，其還可以分泌胸腺激素[9]。整個淋巴器官的發(fā)育和機(jī)體免疫力都必需有T淋巴細(xì)胞，胸腺素可使由骨髓產(chǎn)生的干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞，因而有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的作用。胸腺素能連續(xù)誘導(dǎo)T細(xì)胞分化發(fā)育的各個階段，還能增強(qiáng)成熟T細(xì)胞對抗原或其它刺激的反應(yīng)，惡性腫瘤也有一定療效。脾也是重要的淋巴器官，當(dāng)血液中出現(xiàn)病菌、抗原、異物、原蟲時，脾臟中的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞就會將其吃掉。本研究中干酪乳桿菌低、中、高劑量組胸腺指數(shù)與模型組相比顯均顯著升高，而干酪乳桿菌低、中、高劑量組脾指數(shù)均未見顯著性差異。說明干酪乳桿菌對胃癌的作用可能與胸腺誘導(dǎo)分化的T淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)。

成熟T細(xì)胞表面具有特異性識別抗原并與之結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)TCR受體。外周淋巴器官中大多數(shù)成熟T細(xì)胞的TCR分子，由α鏈和β鏈經(jīng)二硫鍵連接的異二聚體分子TCR-2細(xì)胞完成?，F(xiàn)在已經(jīng)命名了CD1—CD166共180個分化抗原群，其中CD4和CD8是區(qū)分成熟T細(xì)胞亞群的主要表面標(biāo)志[10]。成熟的T細(xì)胞經(jīng)血流分布至外周免疫器官的胸腺依賴區(qū)定居，發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，是身體中抵腫瘤形成的“斗士”。CD4細(xì)胞又稱為免疫系統(tǒng)的輔助手，CD4+T細(xì)胞受到刺激增殖分化為TH0，受不同種白細(xì)胞介素促進(jìn)后分化為TH1和TH2型，TH1型主要參與細(xì)胞免疫，TH2型主要參與體液免疫[11-12]。CD8是T淋巴細(xì)胞的一個亞群，被稱為T細(xì)胞毒細(xì)胞。CD8起源于骨髓，在胸腺內(nèi)成熟，成熟后在隨著淋巴循環(huán)到達(dá)全身各處。細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD8表面蛋白被稱為CD8+T細(xì)胞。本研究表明干酪乳桿菌可使胃癌大鼠模型外周血中TCRαβ+CD161a+、CD4+及CD4+/CD8+均顯著增加，外周血中CD8+均顯著減少。干酪乳桿菌可使胃癌大鼠模型腫瘤組織中TCRαβ+CD161a+、CD8+顯著增加，腫瘤組織中CD4+、CD4+/CD8+均顯著減少。

TLR4由三個區(qū)域構(gòu)成,分別為胞外區(qū)、跨膜段和胞內(nèi)區(qū)，其主要分布于C1D4呈陽性的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上[13]。TLRs介導(dǎo)的先天性免疫細(xì)胞反應(yīng)，可以介導(dǎo)炎癥修復(fù)中所滿足腫瘤發(fā)生的多種特性，越來越多的證據(jù)證明腫瘤相關(guān)的炎癥反應(yīng)通過幫助始腫瘤細(xì)胞獲取特異抗免疫能力,進(jìn)而增加腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。胃癌前病變大部分伴有幽門旋桿菌感染主要的病理變化。TLR4基因的多態(tài)性導(dǎo)致機(jī)體固有的免疫遺傳變異,與胃癌前病變形成相關(guān)TLR4表達(dá)于胃癌及癌前病變的細(xì)胞中,激活如IL8這樣的胃癌發(fā)生健進(jìn)因子,增加了胃癌發(fā)生的風(fēng)險。NF-κB作為早期轉(zhuǎn)錄因子，其激活不需要新翻譯出的蛋白進(jìn)行調(diào)控。因此，NF-κB可以在第一時間對有害細(xì)胞的刺激做出反應(yīng)[14-15]。大多數(shù)的細(xì)菌可以結(jié)合細(xì)胞膜表面的TLRs受體，從而激發(fā)NF-κB信號通路改變基因的表達(dá)。研究已經(jīng)表明LPS可以通過TLR4激活下游NF-κB信號通路[16]。本研究表明干酪乳桿菌可使胃癌大鼠模型腫瘤組織中TLR-4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量均顯著降低，根據(jù)結(jié)果可以推測干酪乳桿菌可能能夠下調(diào)TLR-4、NF-κB p65蛋白表達(dá)，并對TLR-NF-κB信號通路的傳導(dǎo)發(fā)揮抑制作用激活機(jī)體的免疫功能，進(jìn)而增強(qiáng)對惡性腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷活性，避免惡性腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。有國外研究報道[17]，在干酪乳桿菌被機(jī)體吸收過程中，細(xì)胞壁破裂形成病原相關(guān)分子模式，激活機(jī)體免疫應(yīng)激反應(yīng)，與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，干酪乳桿菌可調(diào)節(jié)胃癌大鼠腫瘤組織和外周血中T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞活性，進(jìn)而抑制腫瘤生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)TLR-4、NF-κB p65蛋白表達(dá)，抑制TLR-NF-κB信號通路發(fā)揮作用，其中8 mL/kg的干酪乳桿菌作用效果最佳。本研究重點(diǎn)探討了干酪乳桿菌的輔助抗胃癌腫瘤作用及其免疫學(xué)調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)槲赴┗颊叩呐R床治療方案的探討提供線索，意義重大，但是其在臨床實(shí)踐中應(yīng)用是否具有可行性尚需深入研究。