鐘 燁，王 超，徐 博，劉春輝，陳建立，王曉濤，田 煒，張國志*

(1．華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000；2．開封市中心醫(yī)院，河南 開封 475000；3. 華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，河北 唐山 063000)

甲狀腺癌病理類型主要分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌、髓樣癌，其中甲狀腺乳頭狀癌(thyroid papillary carcinoma，PTC)約占甲狀腺腫瘤的60%，近年來發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，多發(fā)于女性和兒童[1-2]。 PTC主要采用放射性I131和手術(shù)切除兩種治療方法，大部分的PTC雖然預(yù)后良好，十年生存率達(dá)到90%以上，但是部分患者復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差，早期遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移增加了手術(shù)治療的風(fēng)險(xiǎn)性及其預(yù)后的復(fù)發(fā)率[3]。因此研究出一種副作用低、且有效地抑制PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的藥物成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。木犀草素(luteolin，LUT)是一種天然存在的多酚黃酮，以糖苷形式存在于各種水果和蔬菜中，近年來在有關(guān)LUT在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸受到重視[4]。一些富含LUT的植物所衍生的飲食，可能通過一定的藥理學(xué)活性發(fā)揮抗炎、抗癌、抗過敏等作用，從而在減少一些疾病中發(fā)揮重要作用[5]。研究表明，LUT在肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種腫瘤中，具有抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[6-10]。但是LUT在PTC中的作用機(jī)制尚不清楚，本研究將不同濃度的LUT與人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞共同培養(yǎng)后，探討LUT對(duì)TPC-1細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響及其可能的機(jī)制，從而為甲狀腺乳頭狀癌新藥的開發(fā)提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1由天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)，胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，RNA提取相關(guān)試劑盒(日本TaKaRa公司)，聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、qRT-PCR引物(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京GenStar公司)，兔抗人MMP2、MMP9多克隆抗體(英國Abcam公司)、兔抗人AKT、p-AKT多克隆抗體(美國CST公司)，HR標(biāo)記的山羊抗兔二抗、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒及相關(guān)western試劑盒(上海碧云天公司)，Transwell小室(美國Corning 公司)，Matrigel(北京索萊寶科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)、木犀草素(美國Sigma公司)，用DMSO溶解木犀草素(濃度為100 μmol/L)，實(shí)驗(yàn)中其余藥物濃度的配制均采用培養(yǎng)基稀釋。qRT-PCR儀器(中國香港Gene Company Iimited公司)，高分辨率倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

處于對(duì)數(shù)生長期的人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞的培養(yǎng)使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于飽和濕度37℃、5% CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性

首先將處于對(duì)數(shù)生長期的TPC-1細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，然后消化制備成密度為每毫升3×104的單細(xì)胞懸液，吹打均勻后取出每孔100 μL(密度每毫升3×104)細(xì)胞均勻接種于96孔板中，在每個(gè)96孔板周邊加上等量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)， 放入細(xì)胞孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后用不含有FBS的培養(yǎng)基同步化。12 h后棄掉培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍，將細(xì)胞分為3組，空白對(duì)照組中加入DMSO(終濃度小于0.1%)，其余各組加入不同濃度的木犀草素(終濃度分別20 μmol/L, 40 μmol/L)，每組設(shè)置9個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取9個(gè)復(fù)孔的平均值。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入MTT(濃度為5 mg/mL)溶液10 μL，置于37℃細(xì)胞恒溫箱中4 h。棄掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的DMSO，繼續(xù)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱的搖床上震蕩反應(yīng)約10 min。用酶標(biāo)儀在波長490 nm測(cè)量每孔的吸光度(即OD值)，OD值越大，各孔細(xì)胞的存活數(shù)越多。OD值表示細(xì)胞的增殖活性。

1.2.3 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

將空白對(duì)照組(加入等量的DMSO)及不同濃度木犀草素(終濃度為20 μmol/L, 40 μmol/L)培養(yǎng)的TPC-1的細(xì)胞，消化后制備成單細(xì)胞懸液(密度每毫升4×105)。分別取出200 μL/組細(xì)胞懸液均勻接種于Transwell小室的上室膜表面，然后取600 μL不含雙抗的10% FBS的DMEM培養(yǎng)基加入下室內(nèi)。置于細(xì)胞孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 h后清除未穿透上室膜表面的細(xì)胞，PBS沖洗3遍，將穿過小室膜而黏附于下室面的細(xì)胞使用4%多聚甲醛固定30 min以上，蘇木素染色。使用100倍的倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取每組5個(gè)視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)平均值。平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力

首先制備人工重組基底膜Transwell小室，將不含血清DMEM與Matrigel稀釋按1∶3的比例稀釋，混勻后取稀釋液40 uL均勻涂抹于小室的上室表面，放置37℃恒溫孵育箱過夜，次日紫外線燈下照射30 min。將空白對(duì)照組(加入DMSO)及不同濃度木犀草素(20 μmol/L， 40 μmol/L)培養(yǎng)的TPC-1細(xì)胞，消化后制備成密度為每毫升5×105的單細(xì)胞懸液。其余的步驟按照transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)依次進(jìn)行。平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blotting法檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

LUT處理各組細(xì)胞48 h后，將蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑按100∶1混勻后提取TPC-1細(xì)胞中總蛋白，BCA法定量蛋白，煮沸5 min變性，于-80℃保存?zhèn)溆?，每個(gè)泳道按照蛋白量40 μg上樣，12%SDS-PAGE電泳并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(90 V，90 min)。轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗(1∶1000)，GAPDH(1∶2000)。4℃過夜后，0.1%TBST洗膜3次(每次10 min)，加入二抗(1∶1000)后室溫孵育1 h，洗膜3次后，用AI600(美國GE公司)成像，ECL熒光顯色。采用Image J軟件分析條帶的灰度值。各組蛋白表達(dá)量=(蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值)×100%。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

按TRIpure 說明書提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MMP2的上下游基因分別為：5′-3′CCAGCTGGCCTAGTGATGATG和5′-3′CCGCATGGTCTCGATGGTAT。MMP9的上下游基因分別為：5′-3′CGCAGACATCGTCATCCAGT和5′-3′GGATTGGCCTTGGAAGATGA。內(nèi)參GAPDH上下游引物序列分別是：5′-3′CCTGGAAGATGGTGA TGGGATT和5′-3′GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG。PCR擴(kuò)增的條件: 預(yù)變性95℃ 20 s，變性95℃ 5 s， 60℃ 30 s，延伸72℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，各組的CT值均經(jīng)過GAPDH校正后，采用2-ΔΔCT法分別計(jì)算MMP2、MMP9 mRNA相對(duì)表達(dá)量。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的LUT對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

用不同濃度的LUT分別處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，MTT結(jié)果顯示LUT的濃度越高，作用于細(xì)胞的時(shí)間越長，細(xì)胞的OD值越低(即細(xì)胞的增殖活性越低)，木犀草素對(duì)TPC-1細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)一定的時(shí)間—?jiǎng)┝康囊蕾囆?，與空白對(duì)照組相比，木犀草素在濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時(shí)明顯抑制TPC-1細(xì)胞的增殖活性，差異有顯著性(P< 0.05)(如表1、圖1)。

表1 不同時(shí)間段各組細(xì)胞的OD值Table 1 OD values of cells in the groups at various time points

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05。

Note.Compared with blank control group，*P<0.05.

圖1 不同濃度的木犀草素對(duì)TPC-1細(xì)胞的抑制作用(時(shí)間—抑制率)Figure 1 Inhibition of TPC-1 cells by various concentrations of luteolin (time-inhibition rate)

2.2 不同濃度的LUT對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

注：A：細(xì)胞遷移能力的變化(×100)；B：細(xì)胞侵襲能力的變化(×100)；a1和b1為空白對(duì)照組，a2和b2為LUT 20 μmol/L group，a3和b3為LUT 40 μmol/L group；C圖是各組細(xì)胞穿透的細(xì)胞數(shù)；與空白對(duì)照組相比，*P<0.05。圖2 transwell小室檢測(cè)各組穿透的細(xì)胞數(shù)Note. A: Change of cell migration ability(×100); B: Changes of cell invasion ability(×100); a1 and b1 are blank control group, a2 and b2 are LUT 20 μmol/L group, a3 and b3 are LUT 40 μmol/L group; C: the number of cells penetrated of each group; compared with the blank control group, *P < 0.05.Figure 2 Transwell chamber to detect the number of cells penetrated of each group

細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：與空白對(duì)照組穿膜的細(xì)胞數(shù)(50.66±6.73)相比，LUT 20 μmol/L(35.33±7.05)顯著降低，P<0.05；LUT 40 μmol/L (18.35±6.02) 顯著降低，P<0.05。此外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：與空白對(duì)照組穿透細(xì)胞數(shù)(32.33±7.50)相比，LUT 20 μmol/L(24.66±7.02)顯著降低，P<0.05；LUT 40 μmol/L(12.67±8.03)顯著降低，P<0.05，LUT可以明顯抑制TPC-1細(xì)胞遷移和侵襲能力。(圖2)

2.3 LUT對(duì)各組細(xì)胞中AKT、P-AKT、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)的影響

LUT作用于細(xì)胞48 h后提取細(xì)胞總的蛋白，各組中AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)；但與空白對(duì)照組相比，LUT濃度為20 μmol/L和40 μmol/L細(xì)胞中P-AKT、MMP2、MMP9蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(均P<0.05)(圖3)。

2.4 LUT對(duì)各組細(xì)胞MMP2、MMP9 mRNA表達(dá)的影響

不同濃度的木犀草素干預(yù)各組細(xì)胞后，qRT-PCR結(jié)果顯示(如圖4)，木犀草素濃度為20 μmol/L和40 μmol/L組的MMP2、MMP9 mRAN相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

3 討論

木犀草素(3′，4′，5,7-四羥基黃酮)是許多類型

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05。圖3 LUT對(duì)各組細(xì)胞中AKT、p-AKT、 MMP2、MMP9蛋白水平的影響(n=3)Note. Compared with the blank control group, *P<0.05.Figure 3 Luteolin influences the protein expression of AKT, p-AKT, MMP-2, and MMP-9

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05。圖4 LUT對(duì)各組細(xì)胞中MMP2、MMP9 mRAN水平的影響(n=3)Note. Compared with the blank control group, *P<0.05.Figure 4 Luteolin influences the mRNA expression of MMP-2 and MMP-9

植物中常見的類黃酮，以不同形式廣泛地阻止腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，在胃癌、肝癌、宮頸癌等腫瘤中可通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種方式發(fā)揮著抑制腫瘤生長的作用，是一種有效的抗癌劑[11-14]。本研究通過MTT法觀察LUT對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比，木犀草素濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時(shí)均可以有效地抑制TPC-1細(xì)胞的增殖活性(P<0.05)，這與不同濃度的木犀草素抑制人胃癌細(xì)胞增殖活性作用的結(jié)果相一致[12]。

研究表明，侵襲及轉(zhuǎn)移在PTC中的發(fā)病機(jī)制中占有重要的作用[15]。在腫瘤細(xì)胞中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)分泌的MMP包括明膠酶A(MMP2)和明膠酶B(MMP9)，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)屏障(ECM)不僅參與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而且涉及血管生長、炎癥、癌癥的進(jìn)展等[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在PTC中基質(zhì)金屬蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)呈現(xiàn)高表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的浸潤及侵襲轉(zhuǎn)移[17-18]。研究證實(shí)在甲狀腺乳頭狀癌中磷脂酰肌醇-3激酶PI3K/AKT信號(hào)通路可調(diào)節(jié)MMPs活性，從而參與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等作用[19-20]。

在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，LUT通過影響PI3K/AKT信號(hào)通路的活性達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力[21]。在乳腺癌中，木犀草素具有較強(qiáng)的抑制血管生成的作用，通過下調(diào)AEG-1和MMP-2的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲活性[22]。在卵巢癌中，木犀草素可以有效地抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，其機(jī)制可能與MMP2和MMP9的表達(dá)水平的降低有關(guān)[23]。在前期研究表明不同濃度的木犀草素可以抑制TPC-1細(xì)胞的增殖活性，在此基礎(chǔ)上本研究通過采用木犀草素與人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞共培養(yǎng)，體外侵襲遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，木犀草素在濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時(shí)細(xì)胞的侵襲及遷移能力明顯受到抑制，差異有顯著性(P<0.05)。進(jìn)一步探討LUT對(duì)抑制人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞侵襲遷移相關(guān)機(jī)制，Western blotting結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，木犀草素濃度為20 μmol/L和40 μmol/L組中的腫瘤相關(guān)蛋白MMP2、MMP9及PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白P-AKT的表達(dá)水平明顯降低，qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步表明MMP2、MMP9的mRAN也明顯減少，差異有顯著性(均P<0.05)。該結(jié)果與不同濃度的木犀草素有效地抑制肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的研究結(jié)果相一致[8, 21,24-25]。

總之，本研究表明LUT可以有效地抑制甲狀腺乳頭癌TPC-1細(xì)胞的侵襲遷移能力，這一作用可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的活性改變有關(guān)，這為LUT在PTC的治療中提供了一定的理論依據(jù)，有望作為一種新型抗甲狀腺乳頭狀癌的藥物在臨床中應(yīng)用。