陳仙梅 郭碩 袁麗

摘 要：目的 應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測高發(fā)區(qū)賁門癌前病變及早癌血清中相關(guān)差異蛋白，并利用ExPasy數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)差異蛋白峰，探討差異蛋白峰與在腫瘤發(fā)生相關(guān)性。方法 收集來自高發(fā)區(qū)經(jīng)病理證實的血清標本259例，其中53例LGIN組，89例HGIN組，60例IGCA組和57例NOR組，采用弱陽離子交換納米磁珠對血清蛋白進行純化，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜進行檢測。結(jié)果 三組病變組與NOR組比較以及各組間比較，有統(tǒng)計學差異蛋白峰193個，其中由15個差異蛋白峰1025、1190、1212、1315、1547、1561、1612、3452、3518、4485、5527、7992、8712、14063、33313建立的診斷模型為最優(yōu)診斷模型。該模型對賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%，LGIN的靈敏度100.00%，HGIN的靈敏度85.25%，IGCA的靈敏度93.94%。結(jié)論 采用MALDI-TOF-MS聯(lián)合WCX建立診斷模型能夠有效區(qū)分各組病變，對高發(fā)區(qū)自然人群初篩工作有一定的應(yīng)用臨床價值。推測賁門癌的發(fā)生起始于LGIN或更早，但并不是所有的LGIN均發(fā)生癌變。對于表達與腫瘤相關(guān)差異蛋白峰的個體，需要給予內(nèi)鏡等干預(yù)措施。質(zhì)譜技術(shù)為高發(fā)區(qū)早期癌及癌前病變初篩及腫瘤發(fā)生學研究提供一條新的思路。

關(guān)鍵詞：賁門癌；癌前病變；MALDI-TOF-MS；蛋白質(zhì)組學

中圖分類號：R735 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.020

文章編號：1006-1959（2018）23-0072-04

Abstract：Objective MALDI-TOF-MS technique was used to detect the relevant differentially expressed proteins in the serum of precardia and early cancer in high incidence areas， and ExPasy database was used to search the related differentially expressed protein peaks to explore the correlation between differentially expressed protein peaks and tumorgenesis. Methods 259 pathologically confirmed serum samples were collected from the high-incidence areas， including 53 LGIN group， 89 HGIN group， 60 IGCA group and 57 NOR group. Serum proteins were purified by weak-cation exchange nano-magnetic beads and detected by MALDI-TOF-MS mass spectrometry. Results There were 193 statistically significant differentially expressed protein peaks in the pathological changes group， NOR group and each group， among which the optimal diagnostic model was established by 15 differentially expressed protein peaks： 1025， 1190， 1212， 1315， 1547， 1561， 1612， 3452， 3518， 4485， 5527， 7992， 8712， 14063 and 33313. The specificity of this model for precancerous lesions and cancers of cardia was 100.00%， the sensitivity of LGIN was 100.00%， the sensitivity of HGIN was 85.25%， and the sensitivity of IGCA was 93.94%. Conclusion MALDI-TOF-MS combined with WCX in the establishment of a diagnostic model can effectively distinguish between the groups of lesions， and has certain clinical value for the screening of natural population in high incidence areas. It is speculated that the occurrence of cardia cancer begins at LGIN or earlier， but not all LGIN cancers occur. Endoscopic and other interventions should be given to individuals expressing differentially expressed tumor-related protein peaks. Mass spectrometry provides a new idea for the early screening and tumorigenesis of early and precancerous lesions in high incidence areas.

Key words：Cardia cancer；Precancerous lesions；MALDI-TOF-MS；Proteomics

賁門癌（cardia cancer）是常見惡性腫瘤之一，近年來全球遠端胃癌發(fā)病呈下降趨勢，但是賁門癌的發(fā)病卻不斷上升[1]，目前其檢出方式主要依賴于內(nèi)鏡檢查，由于屬于侵入性診療方式，而且其對內(nèi)鏡醫(yī)生技術(shù)要求較高，難以用于與自然人群大規(guī)模普查，所以尋找特異性腫瘤標志物，以縮小內(nèi)鏡篩查范圍，是目前所要解決的首要問題。而傳統(tǒng)的腫瘤標志物多存在特異性、敏感性低等缺點，難以廣泛應(yīng)用于臨床，因此，尋找新的特異性腫瘤標志物顯得尤為重要。質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究的主要技術(shù)之一，具高通量、高靈敏度、高特異性等傳統(tǒng)技術(shù)所不具備的優(yōu)點，能夠高效的檢測組織、體液微量樣本中的腫瘤相關(guān)低豐度蛋白。在眾多質(zhì)譜中，MALDI已廣泛用于肝癌[2]、食管癌[3]、前列腺癌[4]腫瘤蛋白分子研究，本研究應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）結(jié)合WCX磁珠技術(shù)平臺，檢測來自食管癌高發(fā)區(qū)內(nèi)鏡普查及活檢組織病理學證實的賁門腺上皮低級別上皮內(nèi)瘤變（low-grade intra pithelial neoplasia，LGIN）、高級別上皮內(nèi)瘤變（high-grade intra epithelial neoplasia-intramucosal carcinoma，HGIN）、賁門癌（invasive gastric cardia adenocarcinoma，IGCA）和正常對照（Normal control，NOR），試圖為腫瘤高發(fā)區(qū)早期賁門癌及高級別上皮內(nèi)瘤變診斷與臨床篩查探索一種新方法。

1資料與方法

1.1一般資料 血清樣本取自2010年～2011年河北磁縣、涉縣腫瘤內(nèi)鏡篩查人群及河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院內(nèi)鏡科來自高發(fā)區(qū)人群，NOR組取自同期該地區(qū)行內(nèi)鏡篩查的健康人群。本實驗共收集標本259例，其中NOR組57例，LGIN組53例，HGIN組89例，IGCA組60例，進展期賁門癌患者采血前均未經(jīng)放療及化療，所有標本排除肝炎、急性感染、自身免疫性疾病等影響血清蛋白表達的疾病。NOR組男性41例，女性16例，年齡43～76歲，平均年齡（58.70±7.26）歲。LGIN組男性49例，女性4例，年齡45～71歲，平均年齡（57.57±7.02）歲。HGIN組男性71例，女18例，年齡46～74歲，平均年齡（58.80±7.49）歲。IGCA組男性50例，女性10例，年齡45～75歲，平均年齡（61.22±7.74）歲。所有患者均經(jīng)病理學證實。隨機篩選156例標本作為訓練組，包括NOR組33例、LGIN組29例、HGIN組61例、IGCA組33例。剩余103例標本作為盲法驗證組，包括NOR組24例、LGIN組24例、HGIN組28例、IGCA組27例。

1.2實驗方法

1.2.1樣本采集 每例樣本取材包括空腹靜脈血、病史（吸煙、飲酒、家族史、既往史）、知情同意書，檢查對象均排除急性感染、過敏、肝病、自身免疫性疾病等影響血清蛋白質(zhì)表達的疾病。

1.2.2樣品測定 質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置及數(shù)據(jù)采用MALDI（Biorad PBSⅡc）質(zhì)譜儀對制備好的樣品進行質(zhì)譜分析，采用激光源強度為240，加速源電壓為20000 V，檢測器靈敏度為8，真空度為8.387e-007 Torr，掃描質(zhì)量范圍為0～50000 Da，收集次數(shù)為112次/每點，用Ciphergen Protein Chip軟件收集數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS l6.0統(tǒng)計軟件包處理，對各組進行正態(tài)性檢驗（P>0.1）、滿足正態(tài)性的蛋白進行ANOVA檢驗，不滿足條件的蛋白峰行非參數(shù)Kruskal-Wallis H test檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。用Biomarker Wizard TM和Biomarker Patterns TM Software軟件進行數(shù)據(jù)分析，在整個質(zhì)譜圖中定量標定出代表每種蛋白的波峰。

2結(jié)果

2.1建立賁門癌高級別上皮內(nèi)瘤變及粘膜內(nèi)癌診斷模型 應(yīng)用MB-WCX聯(lián)合MALDI-TOF-MS對樣本進行檢測，并進行統(tǒng)計學處理。隨機篩選其中156例樣本在低質(zhì)荷比范圍（0～50000 m/z）范圍內(nèi)檢測，在1000～50000 m/z內(nèi)全部可識別的差異蛋白峰有235個，共有統(tǒng)計學差異的蛋白峰193個（P<0.05）。

2.2利用BPS5.0建立指紋圖譜模型 用BPS分析這些差異蛋白，構(gòu)成診斷模型的15個蛋白峰分別為1025、1190、1212、1315、1547、1561、1612、3452、3518、4485、5527、7992、8712、14063、33313。各峰強度及P值，見表1。

2.3診斷模型的靈敏度及特異性 應(yīng)用產(chǎn)生樹形模型的源數(shù)據(jù)對該模型進行的性能判斷，即對該模型學習能力的判斷。該模型檢驗建立樣本所用的156例源數(shù)據(jù)，該模型對賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%（33/33），LGIN的靈敏度100.00%（29/29），HGIN的靈敏度85.25%（52/61），IGCA的靈敏度93.94%（31/33）。為了驗證上述模型的靈敏度和特異性，對該模型進行盲法測試。擴大樣本量，對未知的103例血清標本進行盲法預(yù)測，驗證結(jié)果表明，對該模型對賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%（24/24），LGIN的靈敏度100.00%（24/24），HGIN的靈敏度92.86%（26/28），IGCA的靈敏度92.59%（25/27），見表2。

3討論

MALDI-TOF-MS是近幾年來發(fā)展起來的一種新型軟電離有機質(zhì)譜技術(shù)，其基本原理是將被測物分散在基質(zhì)分子當中形成晶體，當用一定強度的激光照射時，基質(zhì)分子從輻射中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，然后對結(jié)合蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜測定[5，6]。我們[7]已應(yīng)用MALDI技術(shù)對高發(fā)區(qū)食管癌及正常對照組血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)大量差異蛋白峰，對于早期食管癌及前病變的特異性為90.91%（30/33），對LGIN的靈敏度為100.00%（31/31），HGIN靈敏度為89.66%（52/58），AEC的靈敏度為81.26%（26/32）。Zhu D等[8]采用MALDI-TOF-MS對結(jié)腸癌患者血清進行分析，在訓練組中敏感性及特異性均為100.0%，在測試組中的敏感性為94.4%，特異性為75.5%。我們采用WCX結(jié)合MALDI-TOF-MS對容易獲得的血清標本進行純化分析，經(jīng)統(tǒng)計學處理后各組間存在統(tǒng)計學差異的蛋白峰有194個。輸入BPS建立診斷模型，由15個蛋白峰組成的診斷模型該模型對賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%（33/33），LGIN的靈敏度100.00%（29/29），HGIN的靈敏度85.246%（52/61），IGCA 的靈敏度93.93%（31/33）。另選103例血清標本進行盲法預(yù)測，驗證結(jié)果表明，該模型對該模型對賁門癌前病變及癌的特異性為100.00%（24/24），LGIN的靈敏度100.00%（24/24），HGIN的靈敏度92.86%（26/28），IGCA的靈敏度92.59%（25/27）。該診斷模型能夠很好區(qū)分賁門癌發(fā)生過程的每個時期，而且取材簡單方便、操作快捷，簡便易行，自動化程度高，5 min內(nèi)完成分析。方便用于賁門癌高發(fā)區(qū)自然人群初篩，降低內(nèi)鏡對大規(guī)模人群篩查的成本。

目前對于賁門癌發(fā)生的多階段演進過程分子機制尚不清楚，本研究對BPS建模篩選出來的差異蛋白峰進一步分析，其中1561、1612、7992、14063、1547、33313均自LGIN至IGCA呈高表達，1212、4485自LGIN至IGCA組均呈低表達，5527蛋白在高級別上皮內(nèi)開始升高，在浸潤癌與HGIN組間差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明賁門癌發(fā)生過程中在LGIN時期一些與腫瘤相關(guān)的蛋白可能已發(fā)生改變，且與中晚期癌的變化無明顯差異。Yang J等[9]采用MALDI-TOF-MS及液相色譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)正常對照組與胃癌患者之間存在49種差異蛋白，非轉(zhuǎn)移患者與轉(zhuǎn)移患者之間存在19種差異蛋白。因此，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用使得我們發(fā)現(xiàn)更多與腫瘤相關(guān)未知蛋白，對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展研究具有一定的幫助。

綜上所述，在癌前病變時期部分蛋白分子已經(jīng)發(fā)生改變，對尋找賁門癌及癌前病變的腫瘤標志物具有重要意義，對于大量未知蛋白，我們有必要下一步準備對差異蛋白質(zhì)荷比峰進行分離、純化鑒定，將會進一步增加本實驗?zāi)Ｐ团R床應(yīng)用的可行性，同時也為篩選賁門癌新的腫瘤標志物奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]魏礦榮，陳志峰，彭俠彪，等.食管癌高低發(fā)區(qū)賁門癌發(fā)病對比分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2014，22（1）：59-63.

[2]江紅，李啟英，石洋，等.人原發(fā)性肝癌相關(guān)抗原的蛋白質(zhì)組學初步研究[J].第三軍醫(yī)大學學報，2017，39（1）：72-78.

[3]張浩亮，吳愷，侯智亮，等.食管鱗狀細胞癌血漿外泌體腫瘤標志物的蛋白質(zhì)組學篩選[J].中華實驗外科雜志，2016，33（5）：1370-1373.

[4]Padoan A，Basso D，Zambon CF，et al.MALDI-TOF peptidomic analysis of serum and post prostatic massage urine specimens to identify prostate cancer biomarkers[J].Clin Proteomics，2018，15（23）：1-15.

[5]Cao L，Wang L，Wang G，et al.Evaluation of the effectiveness of a chemoprevention model of pancreatic adenocarcinoma using protein chip technology[J].Int J Oncol，2010，37（6）：1515-1520.

[6]Rodrigo MA，Zitka O，Krizkova S，et al.MALDI-TOF MS as evolving cancer diagnostic tool：A review[J].J Pharm Biomed Anal，2014，7（95）：245-255.

[7]陳仙梅，袁麗，郭碩，等.高發(fā)區(qū)早期食管癌及癌前病變血清蛋白研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2014，8（19）：3416-3421.

[8]Zhu D，Wang J，Ren L，et al.Serum proteomic profiling for the early diagnosis of colorectal cancer[J].J Cell Biochem，2013，114（2）：448-455.

[9]Yang J，Song YC，Dang CX，et al.Identification of serum proteome signatures of locally advanced and metastatic gastric cancer：a pilot study[J].J Transl Med，2015，13（304）：1-11.

收稿日期：2018-9-12；修回日期：2018-9-20

編輯/雷華