張龍翼，張崟，陳平平，陳婷婷，方鑒宇，王林果，柯歡，熊偉

（成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610106）

魚類的皮膚上皮組織中分布有大量粘液細(xì)胞，在應(yīng)激條件下可分泌粘液于體表[1]，構(gòu)成對(duì)外界威脅的有效防護(hù)屏障，起到保護(hù)魚體免遭外界環(huán)境中的病菌、寄生物和病毒侵襲等重要作用[2]。Smith等[3]對(duì)虹鱒魚的體表粘液特性研究，認(rèn)為虹鱒魚體表粘液是不同于魚體血液的另外一種免疫系統(tǒng)。Guo等[4]發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚的黏液具有毒性，低劑量注射小鼠可致其出現(xiàn)水腫或痛覺(jué)，經(jīng)腹腔給藥可致小鼠死亡。Lobb等[5]從羊頭鯛皮膚粘液中，分離出了2種形式的免疫球蛋白。我們課題組在對(duì)白烏魚胴體粘液進(jìn)行初步分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，白烏魚胴體粘液在經(jīng)過(guò)煮沸處理后，其中仍然存在部分微生物[6]，但未對(duì)這些微生物進(jìn)行分離鑒定。鑒于耐熱微生物關(guān)系到后期烹調(diào)或加工魚肉產(chǎn)品的質(zhì)量安全，所以有必要進(jìn)一步明確白烏魚胴體粘液中的耐熱微生物種屬。

白烏魚（Opniocepnalusargusvar kimnra）是我國(guó)自主培育的珍稀淡水魚種，其肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，除具有較高的食用價(jià)值外，還具有一定的藥用和觀賞價(jià)值，未來(lái)市場(chǎng)潛力巨大[7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)白烏魚胴體粘液中的功效成分、微生物等方面研究相對(duì)較少。由于白烏魚宰殺后，其表面有較多粘液，而且其中還存在能耐高溫的微生物，所以如果不對(duì)其中的微生物進(jìn)行分離鑒定，不僅會(huì)引起烹調(diào)或精深加工產(chǎn)品的食用安全隱患，而且可能會(huì)使粘液中的一些功能性微生物隨著粘液的廢棄而浪費(fèi)。此外，微生物通常能產(chǎn)生酶和功能性蛋白質(zhì)，但是大部分微生物的耐熱性不高[8]，尤其在微生物作為酶使用的時(shí)候，耐熱性更加重要。因此，為了進(jìn)一步分析白烏魚胴體粘液中的特征微生物的生物特性，本文對(duì)白烏魚胴體粘液的特征菌進(jìn)行了分離純化，并對(duì)特征菌進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器有THZ-98C恒溫振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；LE104E/02電子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（北京科偉永興儀器有限公司）；智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴t實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)型超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；無(wú)菌操作臺(tái)（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）；SPX-80型生化培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）；UV756CRT紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；YM75ZI智能型不銹鋼立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；XW-80A旋渦混合器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；FR980凝膠成像儀（上海復(fù)日科技儀器有限公司）；2720 thermal cycler PCR儀、3730XL測(cè)序儀（Applied Biosystems）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮白烏魚購(gòu)自成都市龍泉驛區(qū)三聯(lián)汽車城水產(chǎn)市場(chǎng)；蛋白胨購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司；酵母提取物購(gòu)自廣州市華粵瑞科科學(xué)器材有限公司；氯化鈉（分析純）購(gòu)自成都科龍化工試劑廠；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（SK8255）、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒（SK8131）、dNTP購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白烏魚胴體粘液的收集

參考張龍翼等[6]的白烏魚胴體粘液的收集方法。新鮮白烏魚用自來(lái)水暫養(yǎng)，間隔半小時(shí)換一次水，連續(xù)3次，宰殺后刮去魚鱗，然后用乳膠手套輕捋其體表，讓粘液流入滅菌后的器皿中，分裝后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 白烏魚胴體粘液的耐熱性分析

取6份白烏魚胴體粘液5 mL于離心管中，將其中5份離心管分別放在30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃、煮沸條件下熱處理20 min。將0.5 mL純水、0.5 mL新鮮粘液、0.5 mL 30 ℃處理粘液、0.5 mL 50 ℃處理粘液、0.5 mL 70 ℃處理粘液、0.5 mL 90 ℃處理粘液、0.5 mL煮沸處理粘液分別均勻接種到滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中，再放入生化培養(yǎng)箱中，在 37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)狀況，每組平行3次。

1.2.3 特征菌分離及形態(tài)觀察

按無(wú)菌操作用接種環(huán)分別挑取3種單菌落進(jìn)行多次平板劃線培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物，編號(hào)保藏于4 ℃冰箱。觀察各菌株的平板菌落特征，以及在顯微鏡下菌體形態(tài)和染色特征。

1.2.4 菌株耐熱性分析

以無(wú)菌操作挑取菌株，接入LB液體培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)24 h作種子液，分別取盛有50 mL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶5個(gè)，用1 mL無(wú)菌吸管分別準(zhǔn)確吸取1 mL種子液加入5個(gè)三角瓶中，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，放入高壓滅菌鍋中，分別在100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃、121 ℃溫度下處理20 min，然后分別取0.5 mL均勻接種到滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中，再放入生化培養(yǎng)箱中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長(zhǎng)狀況，每組平行3次。

1.2.5 微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定

以無(wú)菌操作分別挑取菌株，接入LB液體培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)18 h作種子液。分別取盛有50 mL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶16個(gè)，分別編號(hào)為0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、24 h。用2 mL無(wú)菌吸管分別準(zhǔn)確吸取2 mL種子液加入已編號(hào)的16個(gè)三角瓶中，于 37 ℃下振蕩培養(yǎng)，分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間將三角瓶取出，測(cè)定OD600值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 16S rDNA 鑒定

按SK8255試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行DNA提取。細(xì)菌16S rDNA引物為27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。采用16S rDNA 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用25 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，模板0.5 μL，16S（F）和16S（R）各0.5 μL，加雙蒸水補(bǔ)足到25 μL。PCR 循環(huán)條件為94 ℃，4 min；20循環(huán)（94 ℃，45 s；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min），72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min電泳觀察。PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，根據(jù)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（SK8131）說(shuō)明書的詳細(xì)步驟進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收純化。得到序列信息后登陸美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息所（national center for biotechnology information，NCBI）頁(yè)面，利用局部相似性基本查詢工具（basic local alignment search tool，BLAST）對(duì)比分析所測(cè)得的序列和GenBank中現(xiàn)有細(xì)菌的16S rDNA序列，挑選相似性序列。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

利用EXCEL 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱處理后白烏魚胴體粘液的變化

由于要對(duì)魚體粘液中的雜菌進(jìn)行熱處理去除，所以必須對(duì)粘液進(jìn)行加熱。通過(guò)不同加熱溫度處理后的魚體粘液見圖1。圖1顯示，未加熱魚胴體粘液呈現(xiàn)淡紅色，隨著加熱溫度上升，魚體粘液由淡紅色逐漸變?yōu)榈G色。這與我們之前報(bào)道的白烏魚體粘液加熱后的顏色變化狀況一致[6]。

未加熱處理的魚胴體粘液呈淡紅色，這可能是魚在宰殺去鱗后收集粘液時(shí)，帶入了一些魚體血液所致；但是經(jīng)過(guò)不同加熱溫度處理后的魚胴體粘液，其顏色由淡紅色逐漸變?yōu)榈G色。血液受熱通常會(huì)變成暗紫色[9]，但是在粘液中的血液受熱后卻變?yōu)榈G色。這與我們之前的研究現(xiàn)象相同[6]。對(duì)引起這一顏色變化的原因還有待進(jìn)一步研究確定。

圖1 熱處理后魚胴體粘液的外表特征Fig.1 Appearance of fish carcass mucus after heat treatment

2.2 熱處理粘液中的微生物分析

圖2 魚胴體粘液的耐熱性比較Fig.2 Comparison of heat resistance of fish carcass mucus

在對(duì)粘液熱處理基礎(chǔ)上，取0.5 mL粘液，在LB固體培養(yǎng)基中于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察微生物的生長(zhǎng)狀況（見圖2）。由圖2可知，隨著加熱溫度增加，粘液中的微生物種類呈明顯減少趨勢(shì)。通過(guò)比較不同溫度下粘液中的微生物種類發(fā)現(xiàn)，粘液中主要有3種菌落（命名為 S1、S2、S3），而且在 50 ℃處理粘液的培養(yǎng)基中有S2和S3，而在70 ℃、90 ℃和煮沸粘液的培養(yǎng)基中，只生長(zhǎng)了S3，空白組中無(wú)菌落生長(zhǎng)。

由圖2中不同溫度處理粘液在培養(yǎng)基上微生物生長(zhǎng)狀況及空白對(duì)照可知，培養(yǎng)基中所生長(zhǎng)的菌落并非空氣中的雜菌，而是魚體粘液中自帶微生物。由培養(yǎng)基中微生物種類隨溫度變化情況可知，50 ℃熱處理導(dǎo)致S1菌死亡，S2和S3菌能耐50 ℃的高溫處理；S3菌最耐熱，在煮沸（96 ℃）溫度下仍然可以存活，這與我們之前的研究結(jié)果相符[6]。

2.3 粘液中3種特征菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察

圖3 平板劃線培養(yǎng)Fig.3 Streak plate culture

為了分析粘液中3種特征菌的生物特性，對(duì)3種單菌落經(jīng)過(guò)平板劃線進(jìn)行分離純化（見圖3）。圖中的三種微生物形態(tài)顯示，所分離得到的S1、S2和S3菌株無(wú)雜菌污染，分離效果好。通過(guò)觀察各菌株的平板菌落特征，以及染色后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)S1菌株革蘭氏染色呈陰性，菌體球桿狀，在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈微黃色，邊緣整齊，表面光滑、濕潤(rùn)；S2 菌株革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體球狀，在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈金黃色，邊緣不整齊，表面粗糙、濕潤(rùn)有光澤；S3菌株革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體桿狀，在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈白色，邊緣不整齊，表面粗糙、不透明。S1、S2和S3菌株特征描述見表1。

2.4 特征菌生長(zhǎng)曲線

圖4 微生物生長(zhǎng)曲線圖Fig.4 Microorganism growth curve

為了進(jìn)一步分析耐熱菌的生物特性，對(duì)耐 50 ℃以上的菌株S2和S3的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見圖4。圖4a中數(shù)據(jù)顯示，0～2 h為菌株S2的生長(zhǎng)停滯期，細(xì)菌數(shù)量極少；2 h以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量急劇增多；14 h達(dá)到生長(zhǎng)最高峰，12～14 h為菌株S2的生長(zhǎng)穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)緩慢；14 h之后細(xì)菌數(shù)量開始減少，菌株S2進(jìn)入衰亡期。圖4b中數(shù)據(jù)顯示，0～1.5 h為菌株S3的生長(zhǎng)停滯期，細(xì)菌數(shù)量極少；1.5 h以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量急劇增多；16 h達(dá)到生長(zhǎng)最高峰，12～16 h為菌株S3的生長(zhǎng)穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)緩慢；16 h之后菌株S3進(jìn)入衰亡期。

由于微生物生長(zhǎng)曲線可表示細(xì)菌從開始生長(zhǎng)到死亡的全過(guò)程動(dòng)態(tài)，對(duì)于研究微生物生理和工業(yè)發(fā)酵具有重要指導(dǎo)意義。由圖4中菌株S2和S3的生長(zhǎng)曲線可知，菌株S2的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和衰亡期菌落數(shù)變化均較菌株S3快速。

表1 特征菌的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of characteristic bacteria

因此，在菌株S2培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格控制OD600值。根據(jù)圖4的生長(zhǎng)曲線可知，對(duì)于菌株S2，采用12～14 h的菌液作為菌種較為合適；對(duì)于菌株S3，采用12～16 h的菌液作為菌種較為合適。這個(gè)階段下的菌株，既可以保持高的細(xì)胞活力，又可獲得多的細(xì)胞數(shù)。

2.5 菌株S3耐熱性比較

圖5 不同溫度處理下菌株S3耐熱性比較Fig.5 Comparison of heat resistance of strain S3 under different temperature treatment

為了進(jìn)一步分析菌株S3的最高耐熱溫度，取0.5 mL菌液，分別在100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃和121 ℃處理，然后分別接種到LB固體培養(yǎng)基中，再放入生化培養(yǎng)箱中于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌株 S3的生長(zhǎng)狀況（見圖 5）。由圖可知，100 ℃和105 ℃處理菌液的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出了菌株 S3，而110 ℃、115 ℃、121 ℃處理菌液的培養(yǎng)基中無(wú)菌落生長(zhǎng)。由圖5中不同溫度處理下菌株S3的生長(zhǎng)狀況可知，菌株S3是一種能耐受105 ℃高溫高壓處理20 min的耐熱菌，當(dāng)溫度達(dá)到110 ℃時(shí)，菌株S3不能存活。因此，菌株 S3可作為物化性質(zhì)類似白烏魚粘液，且中心溫度為105～110 ℃物料殺菌工藝的對(duì)象菌（指示菌），以衡量某殺菌工藝是否徹底。同時(shí)，圖5的殺菌結(jié)果顯示，白烏魚體粘液即使在高溫煮沸處理下，其中仍有活菌存在。因此，有必要對(duì)粘液中的微生物種屬進(jìn)行鑒定，以明確其是否為有害菌。

2.6 粘液中特征菌的種屬鑒定

微生物的16S rDNA結(jié)構(gòu)具有保守性，能反應(yīng)出生物物種的親緣關(guān)系，為生物系統(tǒng)的進(jìn)化提供線索，也是生物物種的特征核苷酸序列。目前，16S rDNA序列分析已經(jīng)成為細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最有力也是最常用的工具。通過(guò)對(duì)S1、S2和S3菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)所得16S rDNA片段進(jìn)行電泳分析，所得結(jié)果見圖6。從電泳結(jié)果可知，3種菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量均為1500 bp左右。用PCR引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序獲得的菌株S1、S2和S3的16S rDNA序列，利用NCBI進(jìn)行BLAST 序列相似性檢索，結(jié)果見表2。

圖6 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoretic results of 16S rDNA PCR amplification products

通常在種的分類等級(jí)上，若兩個(gè)分類單位間的16S rDNA序列的同源性高于97.5%，則可把這兩個(gè)分類單位歸于同一個(gè)種[10]。根據(jù)表2中16S rDNA序列分析結(jié)果可知，菌株S1屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.），與pittii不動(dòng)桿菌（AcinetobacterpittiiStrain）的一致性為 100%；菌株 S2屬于嗜根考克氏菌屬（Kocuriarhizophilasp.），與嗜根考克氏菌（KocuriarhizophilaStrain）的一致性為99%；菌株S3屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.），與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisStrain）的一致性為99%。因此，白烏魚胴體粘液中的高耐熱菌為枯草芽孢桿菌。鑒于枯草芽孢桿菌是需氧菌，少量存在對(duì)人體不僅無(wú)害，而且還有一定的抑菌效果，而pittii不動(dòng)桿菌、嗜根考克氏菌具有潛在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，所以對(duì)于白烏魚的食用，應(yīng)高溫烹調(diào)后再食用較好。

此外，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌具有代謝多樣性，產(chǎn)生的生物表面活性劑可以降解己內(nèi)酰胺、除草劑、有機(jī)磷農(nóng)藥和多種石油烴組分等，在未來(lái)非常有希望應(yīng)用于石油烴的修復(fù)工程[11]。嗜根考克氏菌屬是藥敏實(shí)驗(yàn)的常用靶菌之一[12]，是一種可以產(chǎn)電的微生物，對(duì)改善和提高微生物燃料電池（Microbial fuel cells，MFCs）的產(chǎn)電性能具有重要意義[13]。芽孢桿菌屬對(duì)水產(chǎn)中的有害微生物有很強(qiáng)的抑制作用，在魚類養(yǎng)殖和魚類疾病防治方面表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

表2 16S rDNA鑒定結(jié)果Table 2 16S rDNA identification results

3 結(jié)論

通過(guò)比較熱處理后白烏魚胴體粘液的外表特征，發(fā)現(xiàn)新鮮白烏魚胴體粘液呈淡紅色，隨著處理溫度的升高逐漸呈淡綠色。比較魚胴體粘液的耐熱性，發(fā)現(xiàn)接種了 30 ℃熱處理粘液的培養(yǎng)基有三種菌落（S1、S2和 S3），接種了 50 ℃熱處理粘液的培養(yǎng)基有 S2和S3兩種菌，而接種了70 ℃、90 ℃和煮沸處理粘液的培養(yǎng)基，只生長(zhǎng)了S3菌，空白組中無(wú)菌落生長(zhǎng)。比較粘液中3種特征菌的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)S1為革蘭氏陰性菌，S2和S3為革蘭氏染色陽(yáng)性菌。比較菌株S3的耐熱性，發(fā)現(xiàn)菌株S3在105 ℃高壓滅菌鍋中處理20 min之后仍能存活。通過(guò)測(cè)定菌株S2和S3的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)菌株S2、S3分別在培養(yǎng)14 h、16 h時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)高峰。通過(guò)16S rDNA序列測(cè)序，發(fā)現(xiàn)菌株S1屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）；菌株S2屬于嗜根考克氏菌屬（Kocuriarhizophilasp.）；菌株S3 屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。白烏魚胴體粘液中的高耐熱菌為枯草芽孢桿菌。