肖靜，彭安林，2

（1.武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430070）（2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430072）

肝臟是人體最重要的代謝器官，我們?nèi)粘Ｉ铒嬍乘鶖z取的任何物質(zhì)最后都要經(jīng)過肝臟代謝。當(dāng)長期服用某種藥物達(dá)到一定的攝取量，會造成藥物以及代謝產(chǎn)物的蓄積，進而對肝臟造成直接的損傷，如酒精和四氯化碳等，世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，全球肝損傷、肝炎、肝臟衰竭人數(shù)累計高達(dá)3～4億[1～3]。肝損傷(liver injury）已上升至全球肝病死亡原因的第5位，臨床上1/3的患者并不是死于疾病本身，而是死于肝損傷所引起的急性肝臟衰竭。急性肝損傷往往是由于刺激物例如四氯化碳等直接損傷肝臟誘導(dǎo)一系列惡性氧化應(yīng)激過程，引起的急性炎癥反應(yīng)，最終肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能被破壞[2,4]。國內(nèi)外專家認(rèn)為肝損傷的發(fā)病機制與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，機體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)紊亂失衡，超氧化物岐酶（SOD）清除自由基減少，有害物質(zhì)脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）增多造成大量中性粒細(xì)胞浸潤肝細(xì)胞，氧化中間產(chǎn)物侵襲肝臟組織，Nrf2、HO-1及NQO1等表達(dá)下調(diào)，血清AST和ALT升高加劇肝損傷[2,4,5]。大量研究表明天然產(chǎn)物包括黃酮、多糖類等物質(zhì)，具有清除自由基，抗氧化的能力，可通過減輕炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)肝臟組織氧化產(chǎn)物及蛋白質(zhì)的高表達(dá)而有效緩解 CCl4所致的肝損傷[6,7]。因此，藥食同源的天然產(chǎn)物提供了新的研究方向，從天然產(chǎn)物中尋找有效的單體物質(zhì)，預(yù)防肝損傷具有重要意義。

近年來，花青素的應(yīng)用報道越來越多，主要包括了矢車菊素、飛燕草素、木樨草素等，上述花青素類物質(zhì)都具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種藥理功效，但是卷丹百合花矢車菊素（lilium lancifolium cyanidin）的抗氧化活性、對CCl4所致的肝損傷保護作用及可能的機制尚未見報道。本文依據(jù)文獻方法[7～9]，從卷丹百合花花瓣中分離提取矢車菊素，測定含量后，通過建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST活力值及肝組織勻漿超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px的活力、丙二醛MDA的含量，研究卷丹百合花矢車菊素的抗氧化活性，探討其對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護作用及可能的機制。

1 材料和儀器

1.1 材料與試劑

卷丹百合花花瓣，江蘇南京藝馨花卉有限公司；矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma；四氯化碳 CCl4，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；食用油；無水乙醇，上海生化；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所；GAPDH、Nrf2、HO-1和NQO1等兔抗小鼠抗體均由美國Abcom提供。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機（飛鴿牌系列）；分析天平，HANGPING FA1004；超聲儀，廈門華益通超聲設(shè)備有限公司；恒溫水浴裝置，TB-85型，日本島津公司；酶標(biāo)儀，KHB ST-360，上?？迫A；免疫印跡電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 卷丹百合矢車菊素提取

參考文獻醇提法提取卷丹百合花矢車菊素[9]，步驟如下：將卷丹百合花花瓣粉碎，50 g樣品粉末溶于500 mL 80%乙醇中，侵泡24 h后75 ℃回流提取3 h，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味，再用蒸餾水配成 1 g/mL的百合花醇提物。混合液經(jīng) 101大孔樹脂分離得到卷丹百合花矢車菊素粗提物，收集后經(jīng)武漢市第三醫(yī)院實驗中心HPLC檢測分析，并測定其含量。

1.3.2 卷丹百合矢車菊素含量測定

參考文獻采用衍生化法測定[10]，將卷丹百合花矢車菊素粗提物與25%鹽酸/甲醇溶液（1:1）反應(yīng)1 h，經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾后，采用高效液相色譜配二級管陣列檢測器，色譜柱及檢測條件如下：Agilent HC-C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相0.4%三氟乙酸（TFA）水溶液及0.4% TFA/乙腈溶液（8:2），流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫35 ℃，檢測波長520 nm。以氯化矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品為參照，外標(biāo)法測定計算其含量，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)進行回歸統(tǒng)計，標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=32434.8x (μg/mL）-6264.6，γ=0.999。

1.3.3 動物模型建立及分組處理

1.3.3.1 急性肝損傷模型

根據(jù)文獻報道方法[6,7]構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型，腹腔注射0.3 mL 1% CCl4花生油溶液造模。

1.3.3.2 動物分組、給藥及處理

50只昆明小鼠，雌雄各半，體重20～25 g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2008-0004。將50只小鼠隨機分為空白對照組（S），CCl4組（M），CCl4+卷丹百合矢車菊素低（25 mg/kg，LLC）、中（50 mg/kg，MLC）、高（100 mg/kg，HLC）劑量組，每組 10只。給藥組每日灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，S組和M組則給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥7天。末次給藥2 h后，M組、LLC組、MLC組和HLC組腹腔注射0.3 mL 1% CCl4花生油建立急性肝損傷模型，S組則腹腔注射等體積花生油。各組小鼠造模后不禁水，但禁食24 h，隨后眼眶取血，3000 r/min離心10 min，分離得到血清。小鼠處死稱重后，采集肝臟等臟器組織，稱取肝臟重量以便統(tǒng)計臟器指數(shù)，其余標(biāo)本-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 指標(biāo)檢測

1.3.4.1 生化指標(biāo)測定

取各組小鼠血清上清液，根據(jù)試劑盒說明書操作步驟測定肝功能ALT、AST、ALP指標(biāo)。同時，各組稱取一定量的肝組織，按照1:9的比例采用生理鹽水進行勻漿，制備10%肝組織勻漿樣本，取上清液依據(jù)試劑盒操作步驟，測定SOD、CAT活力和MDA含量。

1.3.4.2 肝臟組織的病理切片觀察

各組小鼠處死肝臟稱重后，取部分肝臟組織固定于 4%多聚甲醛中，石蠟包埋并切片，每張切片厚度為4 μm。然后采用蘇木素伊紅染液行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變，比較各組小鼠肝臟損傷情況。

1.3.4.3 相關(guān)蛋白含量測定：免疫印跡Western-blot

蛋白裂解液提取蛋白樣品，BCA法檢測樣品蛋白含量并調(diào)節(jié)蛋白濃度至相同，加入5×上樣緩沖液沸水浴10 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜結(jié)束后脫脂奶粉封閉PVDF膜。剪下不同區(qū)域的 PVDF膜，分別加兔抗小鼠的GAPDH、Nrf2、HO-1和NQO1抗，體4 ℃孵育過夜，TBST搖床震蕩漂洗8 min×4次；加入1:4000的二抗室溫孵育1 h，TBST搖床震蕩漂洗8 min×4次；ECL法曝光顯影。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，先進行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗，方差齊性檢驗，計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異用單因素方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷丹百合花矢車菊素含量測定

圖1a為10 μg/mL氯化矢車菊素高效液相色譜圖，卷丹百合花矢車菊素粗提物如圖1b所示。根據(jù)所得回歸曲線方程，卷丹百合花矢車菊素含量為47.6 μg/mL。

2.2 卷丹百合花矢車菊素對小鼠肝臟臟器指數(shù)及肝功能的影響

圖1 氯化矢車菊素和樣品高效液相色譜圖Fig.1 High-performance liquid chromatography of cyanidin chloride and sample

CCl4進入肝臟組織后，在肝微粒體細(xì)胞色素P450酶作用下生成自由基：三氯甲基和氯自由基，直接侵襲肝細(xì)胞，造成脂質(zhì)過氧化損傷，破壞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[8]。血清中，ALT、AST和ALP是反應(yīng)肝功能的特異性指標(biāo)，肝臟臟器指數(shù)則是反映肝細(xì)胞炎性病變的重要指標(biāo)，酶活性升高，肝臟臟器指數(shù)增加提示肝臟可能受損。當(dāng)肝臟損傷時，AST、ALT和ALP等物質(zhì)從肝細(xì)胞胞漿內(nèi)釋放到血液中。如圖2所示，本研究檢測發(fā)現(xiàn)，M組小鼠血清中ALT、AST和ALP水平分別為（51.64±7.53）U/L，（84.36±12.68）U/L 和（71.52±11.28）U/L，S 組則分別是為（14.75±5.16）U/L，（23.54±8.46）U/L 和（21.54±7.24）U/L。與此同時，M組肝臟臟器指數(shù)由6.54升高至7.86。M組酶活性升高了3～4倍，肝臟臟器指數(shù)顯著增加，和S組比較結(jié)果有顯著性差異(p＜0.05)，這證實腹腔注射CCl4造成了急性肝損傷。給予不同劑量的卷丹百合花矢車菊素灌胃干預(yù)后，小鼠血清中ALT、AST和ALP水平有所下降，肝護臟臟器也明顯降低，尤其是HLC組，ALT、AST和ALP顯著降低至（15.67±5.38）U/L，（35.58±8.68）U/L 和（31.38±8.57）U/L，臟器指數(shù)為6.58±0.24，幾乎恢復(fù)至正常狀態(tài)。卷丹百合花矢車菊素對小鼠急性肝損傷的改善效果隨藥物濃度的增加而增加，護肝作用呈現(xiàn)劑量依賴性，這與趙冠華等探究結(jié)果一致[7,8]。

圖2 卷丹百合花矢車菊素對血清中ALT、AST和ALP的影響Fig.2 Effects of Lilium lancifolium cyanidin on the levers of ALT, AST and ALP in mice

表1 卷丹百合花矢車菊素對小鼠肝臟臟器指數(shù)的影響Table 1 The effect of Lilium lancifolium cyanidin on the liver index in mice

2.3 卷丹百合花矢車菊素對 SOD、CAT及MDA的影響

在CCl4刺激肝臟導(dǎo)致急性肝損傷過程中，機體內(nèi)的氧化和抗氧化過程失衡從而激活氧化應(yīng)激過程，產(chǎn)生的大量氧化中間產(chǎn)物誘導(dǎo)一系列的炎癥反應(yīng)，加劇疾病進展。當(dāng)CCl4進入肝臟后產(chǎn)生大量的氧自由基，與細(xì)胞膜上的磷脂結(jié)合后會生成脂質(zhì)過氧化物，最終形成丙二醛（MDA）引起細(xì)胞進一步損傷。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，能清除CCl4生成的自由基，減少過氧化物對肝細(xì)胞的侵襲損害。從圖3可知，M組小鼠肝臟組織中SOD（19.64±6.53 U/mg pro）和 CAT（10.36±4.68 U/mg pro）酶活力顯著低于S組SOD（40.75±3.16 U/mg pro）和CAT（24.54±3.46 U/mg pro）水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），說明 CCl4損傷肝臟后，機體內(nèi)氧化和抗氧化失衡，清除自由基能力明顯降低。給藥干預(yù)后，低中高劑量組小鼠肝臟組織SOD和CAT活力與M組比較有不同程度的增加。其中，MLC組SOD和 CAT 分別上升至（29.34±7.25 U/mg pro）和（17.65±5.19 U/mg pro）；HLC組上述指標(biāo)則分別為（36.67±5.47 U/mg pro）和（21.58±4.62 U/mg pro），抗氧化活力幾乎接近空白對照組，與M組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05）。

與此同時，自由基損傷肝臟細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物最終會形成MDA，MDA水平反映了肝臟損傷的程度。本實驗得到，M組MDA（12.84±2.17 nmol/mg pro）較S組（3.67±1.25 nmol/mg pro）顯著升高，證實CCl4造模成功。LLC、MLC和HLC組MDA含量分別為（8.95±2.01 nmol/mg pro）、（6.29±1.78 nmol/mg pro）和（4.67±1.42 nmol/mg pro），表明卷丹百合花矢車菊素可以顯著降低小鼠肝組織MDA含量。卷丹百合花矢車菊素可能是通過上調(diào)SOD、CAT活性，降低MDA含量來緩解氧化應(yīng)激，改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。

圖3 卷丹百合花矢車菊素對小鼠肝組織SOD、CAT及MDA的影響Fig.3 The effect of Lilium lancifolium cyanidin on SOD, CAT and MDA in liver tissue of mice

2.4 卷丹百合花矢車菊素對 CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝組織病理的影響

小鼠肝組織病理檢測結(jié)果如圖4所示，S組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞條索排列有序，細(xì)胞形態(tài)正常無壞死及炎性細(xì)胞浸潤。M組小鼠肝臟組織病理切片可見肝小葉邊界模糊不清，肝索排列雜亂，肝細(xì)胞明顯腫大，大量炎性細(xì)胞浸潤，表明CCl4造模成功。對比觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組肝細(xì)胞形態(tài)較M組有所改善，細(xì)胞腫脹減小，炎性細(xì)胞浸潤降低，尤其是 HLC組肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞條索排列有序，無炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞形態(tài)基本正常，接近空白對照組。給藥干預(yù)后，小鼠肝組織病理改善效果顯著，說明卷丹百合花矢車菊素對抑制 CCl4所致急性肝損傷有保護作用，中高劑量組和模型組相比較有顯著的改善。

圖4 卷丹百合花矢車菊素對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝組織病理的影響Fig.4 The effect of lilium lancifolium cyanidin on hepatic tissue pathology of liver injury mice induced with CCl4 (HE×100)

2.5 卷丹百合花矢車菊素對Nrf/OH-1/NQO1信號通路的影響

核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2作為氧化應(yīng)激的感受器，是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，在參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的主要防御機制中發(fā)揮重要的作用。Nrf2可激活血紅素單加氧化酶-1（OH）和醌氧化還原酶（NQO1）大量表達(dá)，增加機體抵抗力，維持機體正常運轉(zhuǎn)。HO-1和NQO1可以降低組織對氧化應(yīng)激的敏感性，減少細(xì)胞損傷和凋亡[2,6]。一般情況下，Nrf2和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Keap1等結(jié)合成二聚體存在于細(xì)胞胞漿中，使細(xì)胞的酶和抗氧化物處于基礎(chǔ)穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)外界氧化應(yīng)激刺激時，細(xì)胞胞漿中的Nrf2磷酸化轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，進而啟動下游SOD、CAT、OH-1和NQO1的表達(dá)。CCl4損傷肝臟，引起肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，肝細(xì)胞胞漿中的Nrf2進入胞核，M組肝組織細(xì)胞胞漿中 Nrf2、表達(dá)較 S組明顯下調(diào)（p＜0.05），其下游信號通路中的OH-1、NQO1水平也顯著降低（p＜0.05），這和氧化應(yīng)激中測定的SOD、CAT及MDA結(jié)果相符合。給藥干預(yù)后，小鼠肝組織中Nrf2、OH-1、NQO1較M組表達(dá)有所增加，MLC和HLC組增加量與M組比較有顯著性差異（p＜0.05），說明卷丹百合花矢車菊素能激活核轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2蛋白水平上調(diào)，Nrf2活化后調(diào)控下游OH-1和NQO1的高表達(dá)，抗氧化反應(yīng)的物質(zhì)SOD、CA增加，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶水平升高，脂質(zhì)過氧化物MDA生成減少，實現(xiàn)抗氧化，逆轉(zhuǎn)肝損傷，和他人的結(jié)果一致[11]。

圖5 卷丹百合花矢車菊素對Nrf/OH-1/NQO1信號通路的影響Fig.5 The effect of Lilium lancifolium cyanidin on Nrf2, OH-1 and NQO1 in liver tissue of mice

3 結(jié)論

總體來說，卷丹百合花矢車菊素預(yù)處理改善CCl4誘導(dǎo)的肝損傷，可能是通過上調(diào)Nrf2、OH-1、NQO1的表達(dá)增強抗氧化酶 SOD、CAT活性，降低脂質(zhì)或氧化物MDA含量，下調(diào)血清中AST、ALT、ALP水平，減緩肝臟脂肪病變而發(fā)揮護肝作用，其保護機制可能是通過Nrf2/OH-1/NQO1信號通路介導(dǎo)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，實現(xiàn)清除自由基、減輕脂質(zhì)過氧化及保護肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能正常的效應(yīng)。