葉 蕾 余亞平 陳芝蕓 嚴(yán)茂祥 何蓓暉 蔡丹莉

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

肝纖維化是肝臟慢性炎癥反復(fù)的結(jié)果，其特點是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解失衡導(dǎo)致其在肝臟內(nèi)過度沉積[1]。在細(xì)胞和分子水平，這一過程主要表現(xiàn)為肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）活化和轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-beta，TGF-β)及其下游信號分子異常激活；Smads蛋白為TGF-β信號最重要胞內(nèi)效應(yīng)因子，介導(dǎo)其核內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并調(diào)節(jié)TGF-β家族的正、負(fù)反饋[2]。補腎化瘀方是筆者臨床治療肝纖維化的經(jīng)驗方，以往研究[3]表明，該方能抗肝纖維化、改善肝組織炎癥和肝功能的作用,本研究探討補腎化瘀方對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1及其Ⅰ受體、Smad3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SD大鼠30只，雄性，SPF級，體重140±10g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2013-0016]。

1.2 補腎化瘀方制備：由仙靈脾、黨參、積雪草各15g，黃精20g，女貞子、郁金各12g，虎杖24g，丹參30g等組成，浙江省中醫(yī)院制劑中心制成4.4g/ml的流浸膏。

1.3 主要試劑及儀器：CCl4由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供；TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript? RT Master Mix(Perfect Real Time)及SYBR? Premix Ex Taq? II(TliRNaseH Plus)由寶生物工程（大連）有限公司提供。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、TGF-β1兔單抗為美國Abcam公司產(chǎn)品，Smad3鼠單抗為美國Santa Cruz公司產(chǎn)，超敏酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。AB17900PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品，Nikon eclipse 80i光學(xué)顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.4 實驗方法：30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組、模型組、補腎化瘀方組共3組，每組10只。模型組和補腎化瘀方組以橄欖油稀釋的40%CCl4皮下注射，0.3ml/100g，首劑加倍，2次/周，共6周；正常組以等容量橄欖油皮下注射代替；同時補腎化瘀方組每天灌服4.4g/ml的補腎化瘀流浸膏1ml/100g，正常組和模型組則每天以等容量的生理鹽水灌胃，均連續(xù)6周。于末給藥次當(dāng)晚禁食不禁水16h，次日空腹麻醉下處死，收集肝臟標(biāo)本，部分存于-80℃用于熒光定量PCR檢測，部分肝右葉組織10%中性甲醛中固定，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，用于免疫組化檢測。肝組織α-SMA、TGF-β1及其Ⅰ型受體[TGF-β receptorⅠ（TβRI）]、Smad3等基因mRNA表達(dá)采用實時熒光定量PCR檢測，以β-actin為內(nèi)參，相對表達(dá)量（2-△△Ct）表示目標(biāo)基因表達(dá)量，引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計并合成。引物基因序列見表1。

表1 引物基因序列

肝組織α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)采用免疫組化檢測。結(jié)果判斷：α-SMA陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿呈棕黃色，少部分膜表達(dá)；TGF-β1陽性細(xì)胞為胞漿呈棕黃色；Smad3陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿/核呈棕黃色；以陽性細(xì)胞著色程度和范圍進(jìn)行半定量[4]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示。行正態(tài)性檢驗，非正態(tài)分布資料轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ和Smad3基因mRNA表達(dá)的影響：模型組大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ及Smad3三者mRNA表達(dá)較正常組顯著上調(diào)（P＜0.01），應(yīng)用補腎化瘀方干預(yù)后，肝組織上述基因mRNA表達(dá)較模型組明顯下調(diào)（P＜0.05,P＜0.01），見圖1。

圖1 肝組織α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ及Smad3mRNA的表達(dá)（±s,n=10）

2.2 補腎化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、TβRⅠ、Smad3蛋白表達(dá)的影響：模型組大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平較正常組明顯增強（P＜0.01），補腎化瘀方組組大鼠肝組織α-SMA、TGF-β、Smad3的表達(dá)較模型組不同程度下降（P＜0.05,P＜0.01），見表2。

表2 補腎化瘀方對肝組織α-SMA、TGFβ1、Smad3蛋白表達(dá)的影響（±s,n=10）

表2 補腎化瘀方對肝組織α-SMA、TGFβ1、Smad3蛋白表達(dá)的影響（±s,n=10）

Smad3 0.80±0.75 3.85±0.97**2.35±0.71**#分組正常組模型組補腎化瘀方組α-SMA 1.40±0.52 4.65±1.38**3.00±0.82**#TGF-β1 1.10±0.74 5.10±1.20**2.70±0.92**##

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 討論

ECM主要來源于HSC，HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是肝纖維化形成的核心。TGF-β1作為最重要的促HSC活化的細(xì)胞因子，由肝巨噬細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等合成分泌，激活HSC，同時能促進(jìn)HSC自分泌、旁分泌TGF-β1，產(chǎn)生自我增殖的循環(huán)過程，活化臨近HSC大量合成膠原[5]。細(xì)胞外TGF-β1與細(xì)胞表面TβR相互結(jié)合，能夠激活其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子smad2/3/4蛋白，形成復(fù)合物，最終轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，直接或參與調(diào)節(jié)因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合子，以誘導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[6]；因此有研究認(rèn)為，抑制TGF-β1的表達(dá)和TGF-β/smad信號通路的激活，是阻斷肝纖維化的關(guān)鍵[7]。

補腎化瘀方由仙靈脾、黃精、女貞子、黨參、虎杖、郁金、丹參、積雪草等組成，具有補腎益氣，化瘀解毒等功效[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化模型大鼠HSC活化標(biāo)志物α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)均較正常組明顯上調(diào)，TGF-β、TβRⅠ、Smad3的表達(dá)也較正常組顯著增強；而補腎化瘀方干預(yù)后能抑制上述關(guān)鍵分子mRNA和蛋白的過表達(dá)，提示模型大鼠肝組織HSC活化，TGF-β1/Smad3信號通路激活，補腎化瘀方能降低肝組織中TGF-β1、TβRⅠ及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad3的mRNA及蛋白表達(dá)水平，從而抑制HSC活化增殖、抑制TGF-β1通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad3促肝纖維化的作用。