李翠霞　蘇秀蘭

[摘要] 斑馬魚因具有體外受精、胚胎透明及繁殖能力強(qiáng)等小模式生物獨(dú)特優(yōu)勢，近十年已經(jīng)被廣泛作為人類相關(guān)性疾病研究模型。目前針對斑馬魚的基因操作技術(shù)已相當(dāng)成熟，靶向性地誘導(dǎo)或敲除體內(nèi)某些基因，改變其表達(dá)水平，可以很容易地在斑馬魚上復(fù)制人類的一些腫瘤性疾病狀態(tài)，因此適合建立斑馬魚各種類型腫瘤模型，并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究。本文就斑馬魚作為腫瘤模型的優(yōu)勢及斑馬魚各種類型腫瘤模型的研究做一綜述，分析斑馬魚作為模式動物在抗腫瘤藥物的研究中的應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞] 斑馬魚；腫瘤模型；藥物研究；應(yīng)用價值

[中圖分類號] R73-35 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（b）-0022-04

[Abstract] Zebrafish have been successfully widely used as a research models for human-related diseases in the past decade due to their unique advantages in small-scale Organisms such as in vitro fertilization， embryo transparency and strong reproductive ability. At present， the gene manipulation technology for zebrafish has been quite mature， Targeting to induce or knock out certain genes in the body and change its expression level， it is easy to replicate some human tumor diseases on zebrafish， so various types of zebrafish tumor models can be established， and are suitable for conducfing reserch on related mechanisms. This article reviews the advantages of zebrafish as a tumor model and the research of various types of zebrafish tumor models， and the application value of zebrafish as a model animal in the study of anti-tumor drugs was analyzed.

[Key words] Zebrafish； Tumor model； Drug research； Application value

近年來，我國患腫瘤的發(fā)病率和死亡率迅速上升，為了進(jìn)一步了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制，明確其致病機(jī)制對人類健康十分重要。動物模型是研究人類疾病的重要工具。斑馬魚基因組和人類基因組有高度同源性，作為一種新型整體實(shí)驗(yàn)動物模型具有極大的優(yōu)勢。由于斑馬魚具有透明及繁殖能力強(qiáng)的特點(diǎn)，更易于用于開展腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究及腫瘤藥物篩選，以及研究腫瘤生物學(xué)特性等工作。本文主要就斑馬魚作為腫瘤模型的優(yōu)勢及斑馬魚各種類型腫瘤模型的研究給予綜述。

1 斑馬魚作為腫瘤模型的優(yōu)勢

斑馬魚是一種產(chǎn)于南亞的熱帶魚，近年來被廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究及藥物的研發(fā)。作為一種新型的整體實(shí)驗(yàn)動物模型，與小鼠相比，斑馬魚具有以下優(yōu)點(diǎn)：①斑馬魚胚胎發(fā)育在母體外進(jìn)行，在受精24 h內(nèi)許多器官已經(jīng)發(fā)育，用顯微鏡可以實(shí)時活體觀察。②胚胎透明，可以使用顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的人類腫瘤細(xì)胞，這有助于我們更好地了解生物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的行為，研究腫瘤生物學(xué)特性。③繁殖能力強(qiáng)。單個交配每周可產(chǎn)生數(shù)百個胚胎，可獲得足夠的胚胎以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。④斑馬魚可顯著減少藥物——腫瘤反應(yīng)的時間，其中使用患者來源的細(xì)胞在治療72 h后可成功獲得藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)[1]。與其他臨床前模型相比，可以以更低的成本實(shí)時獲得患者特異性療法[2]。由于這些獨(dú)特的特性，斑馬魚有助于推動驅(qū)動脊椎動物腫瘤進(jìn)展的機(jī)制的研究，并提供以信息，以低成本和高效率的方式開發(fā)有前途的臨床前藥物。

2 各種類型腫瘤斑馬魚模型的研究

目前，斑馬魚作為腫瘤模式生物日益受到關(guān)注。國內(nèi)外研究人員結(jié)合生物相關(guān)技術(shù)已相繼利用斑馬魚建立了多種疾病模型。本文主要闡述白血病、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌及結(jié)腸癌等斑馬魚模型的研究。

2.1 斑馬魚白血病模型

白血病的體外研究和新藥的研發(fā)都離不開實(shí)驗(yàn)動物模型，所有的脊柱動物都有發(fā)生白血病的可能。斑馬魚白血病模型的建立對于了解人類白血病的發(fā)生、發(fā)展及藥物研究都具有重要的作用。2003年，Langenau等[3]首次建立T淋巴細(xì)胞白血病斑馬魚模型，向斑馬魚體內(nèi)注入含編碼淋巴細(xì)胞特異啟動子rag2，驅(qū)動鼠源性c-Myc基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)斑馬魚體內(nèi)熒光標(biāo)記的白血病細(xì)胞植入免疫缺陷的胸腺，提示原癌基因c-Myc參與斑馬魚腫瘤的形成。前期報(bào)道N-Myc蛋白是人類急性髓細(xì)胞白血?。ˋLM）預(yù)后不良的標(biāo)志，而MYCN致癌基因在ALM中發(fā)揮作用的分子機(jī)制在很大程度上是未知的。Shen等[4]通過熱休克蛋白啟動子將小鼠MYCN基因引入胚胎斑馬魚，并建立了穩(wěn)定的種系Tg（MYCN：HSE：EGFP）斑馬魚，利用外周血涂片檢測，組織學(xué)切片和流式細(xì)胞儀分析腎臟和脾臟單細(xì)胞懸液，發(fā)現(xiàn)MYCN過表達(dá)使N-Myc蛋白增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的再生活性和未成熟的造血細(xì)胞的積累，說明MYCN基因在AML的病因?qū)W中起作用。因此，可以利用MYCN轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型識別潛在的治療靶點(diǎn)。卿愷等[5]為深入探討Notch1基因在促進(jìn)急性T淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制，將構(gòu)建的Rag2-ICN1-EGFP質(zhì)粒顯微注射到斑馬魚胚胎單細(xì)胞周期，并建立穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)基因魚系。轉(zhuǎn)基因F1代斑馬魚與在血管內(nèi)皮增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的斑馬魚系（flil-EGFP）比較，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞比例顯著降低，淋巴細(xì)胞比例明顯增高。說明轉(zhuǎn)Notch1基因紅綠雙色熒光追蹤的急性T淋巴細(xì)胞白血病斑馬魚模型已成功建立，同時，利用這種模型研究為抗急性T淋巴細(xì)胞白血病的新藥提供了平臺。

2.2 斑馬魚黑色素瘤模型

黑色素瘤是異常黑色素細(xì)胞過度增生引發(fā)的皮膚腫瘤，其惡性程度及死亡率非常高，是皮膚癌中最難治愈的腫瘤[6-7]。盡管目前黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制及治療方面的研究取得巨大成就，但黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制與微環(huán)境相互作用等的研究具有具限性。黑色素瘤細(xì)胞通過與微環(huán)境相互作用，達(dá)到快速生長和轉(zhuǎn)移的目的[8]。因此，建立活體斑馬魚黑色素瘤模型對黑色素瘤發(fā)病機(jī)制及抗黑色素瘤藥物研究十分重要。Taylor等[9]建立了轉(zhuǎn)基因mitfa黑色素瘤斑馬魚模型，研究mitfa基因在黑色素瘤的功能，使用正在發(fā)育中斑馬魚的延時成像顯示，mitfa對細(xì)胞周期停滯與黑色素細(xì)胞分化至關(guān)重要，并強(qiáng)調(diào)mitfa活性水平在黑色素細(xì)胞狀態(tài)中的重要性。研究者發(fā)現(xiàn)，在成魚中，將mitfa保持在中等活性水平則很少自行導(dǎo)致痣，但與BRAFV600E結(jié)合以與p53突變相似的發(fā)病率促進(jìn)痣和黑色素瘤的發(fā)展。該模型提供了mitfa在動物中與BRAFV600E結(jié)合的第一個體內(nèi)證據(jù)。Santoriello等[10]為了檢測癌基因在不同啟動子調(diào)控下的作用，則利用Ga14-UAS途徑建立了斑馬魚黑色素瘤模型，將UAS-HRAS轉(zhuǎn)基因斑馬魚與Ga14啟動子轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行雜交，利用囊胚移植模型研究，發(fā)現(xiàn)kita啟動子可以驅(qū)動致癌HRASGV12基因在1～3個月發(fā)展成黑素瘤，且不需要腫瘤抑制因子突變的共同參與，而在HRASGV12基因的表達(dá)下mitfa啟動子沒有重現(xiàn)kita-GFP-HRASGV12表型，這可能與較低的HRAS轉(zhuǎn)基因表達(dá)有關(guān)。Ablain等[11-12]最近利用斑馬魚開發(fā)了一種組織特異性CRISPR/Cas9系統(tǒng)，允許特異性敲除任何目的基因，結(jié)合MCR過表達(dá)和MCR敲除策略研究HEXIM在黑色素瘤形成中的作用。Tan等[13]將HEXIM鑒定為黑色素瘤中的一種新型腫瘤抑制因子，其在體內(nèi)過表達(dá)能抑制腫瘤形成，而其失活則能加速腫瘤發(fā)作。這進(jìn)一步了解對其腫瘤產(chǎn)生的影響，為藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

2.3 斑馬魚肝癌模型

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一，2011年Zheng等[14]統(tǒng)計(jì)我國每年死于肝癌的人數(shù)為32.3萬，病死率為23.93/10萬，因此加強(qiáng)對肝癌的研究仍然是保障民生的重要任務(wù)。在過去幾十年的研究中，雖然大量的致癌基因、抑癌基因都證明與肝癌的發(fā)生有關(guān)，但是對肝癌的了解仍然很有限，肝癌治療效果仍不理想。從實(shí)驗(yàn)室研究到臨床應(yīng)用是一個艱難的過程，動物模型實(shí)驗(yàn)是肝癌研究的重要途徑，也是臨床治療的重要參考。新加坡國立大學(xué)宮知遠(yuǎn)研究團(tuán)隊(duì)[15-17]通過多個與肝細(xì)胞癌相關(guān)的基因研究，分別構(gòu)建出xmrk/kras或myc基因突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型。該研究使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚穩(wěn)定體內(nèi)肝癌模型，以闡明kras基因驅(qū)動肝癌發(fā)生的機(jī)制。為了克服上述轉(zhuǎn)基因魚因致癌基因不可控制的持續(xù)表達(dá)所造成的應(yīng)用局限性，Nguyen等[18]首次建立肝特異性腫瘤模型，利用肝特異性脂肪酸結(jié)合蛋白FABP10啟動子在轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟中特異性地過表達(dá)致癌krasV12，研究發(fā)現(xiàn)高水平的krasV12表達(dá)可以引發(fā)肝癌發(fā)生，并且還發(fā)現(xiàn)致癌基因krasV12在腫瘤形成前階段引發(fā)p53激活，進(jìn)而抑制腫瘤的生長。為了驗(yàn)證斑馬魚肝特異性腫瘤模型構(gòu)建成功[19]，向野生型斑馬魚成魚中植入EGFP-KrasV12熒光標(biāo)記的肝癌細(xì)胞，2個月后，正常的斑馬魚也發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞。xmrk或myc基因突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)，xmrk或myc基因均顯示過量表達(dá)，從而誘發(fā)肝組織增生以及癌變，四環(huán)素撤離后，肝臟腫瘤病變減弱[20]。這一發(fā)現(xiàn)模仿了人類肝癌的形成，為人類抗肝癌藥物的研究提供了平臺。Eeason等[21]構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)型，使肝細(xì)胞特異性過表達(dá)β-catenin，2個月后33%實(shí)驗(yàn)個體開始表現(xiàn)肝細(xì)胞癌，12個月后80%。利用該肝細(xì)胞癌模型進(jìn)行藥物治療，發(fā)現(xiàn)了JNK信號通路抑制劑有助于減小癌變肝臟體積，這為肝細(xì)胞癌治療提供了新的方案。

2.4 斑馬魚乳腺癌模型

乳腺癌是女性惡性腫瘤致死的主要原因，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率有上升和年輕化趨勢。許多情況下，乳腺癌患者并不是死于原發(fā)腫瘤，而是因?yàn)檗D(zhuǎn)移引起其他并發(fā)癥。雖然許多鋸齒動物模型可用于體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移研究，但是費(fèi)用高及周期長；而低成本的斑馬魚乳腺癌模型可快速獲得腫瘤在體內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程及檢測藥物的療效。Ren等[22]利用顯微鏡將人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞移植到轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli：EGFP）胚胎中，植入后不久，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白標(biāo)記的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞在活體魚體內(nèi)侵襲、轉(zhuǎn)移的全過程，發(fā)現(xiàn)注射到卵周細(xì)胞空間的可以觀察腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)血管生成。結(jié)合細(xì)胞標(biāo)記、微移植和熒光成像技術(shù)，能夠快速評估腫瘤轉(zhuǎn)移情況以響應(yīng)藥物的治療。de Boeck等[23]利用斑馬魚乳腺癌異種移植模型研究了BMP信號在早期轉(zhuǎn)移過程中的作用。將乳腺癌MCF10A M2細(xì)胞移植入斑馬魚Tg（fli：EGFP）胚胎中，觀察BMP信號對侵襲和微轉(zhuǎn)移的影響，通過穩(wěn)定過表達(dá)抑制性Smad6（一種BMP特異性抑制性Smad）抑制人乳腺癌細(xì)胞系中的BMP信號傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)Smad6抑制BMP信號傳導(dǎo)，顯著增強(qiáng)體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的侵襲。Li等[24]研究αv整合素在乳腺癌MDA-MB-231、MCF10A-M4細(xì)胞遷移中的作用，通過敲除乳腺癌MDA-MB-231和MCF10A-M4細(xì)胞中的αv整合素或用αv整合素拮抗劑GLPG0187，建立斑馬魚乳腺癌異種移植模型，在熒光顯微鏡下觀察活體魚體內(nèi)乳腺癌MDA-MB-231和MCF10A-M4細(xì)胞的遷移情況，結(jié)果顯示敲除αv整合素有效減輕乳腺癌細(xì)胞的遷移。Hong等[25]為了研究SHOX2對乳腺癌的作用，建立乳腺癌斑馬魚異種移植模型，結(jié)果表明SHOX2是乳腺癌中的轉(zhuǎn)移促進(jìn)蛋白。

2.5 斑馬魚結(jié)腸癌模型

隨著生活節(jié)奏的加快，結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢。放射療法顯著降低直腸癌患者的局部復(fù)發(fā)，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的速度仍然很高。Snosa等[26]評估了AEG-1是否參與體外輻射增強(qiáng)的遷移和侵襲，將三種結(jié)腸癌SW480、SW620和HCT116細(xì)胞及各自穩(wěn)定的AEG-1敲低細(xì)胞系注射到斑馬魚胚胎中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有AEG-1敲低細(xì)胞系中遷移和侵襲減少。此外，研究者觀察到輻射增強(qiáng)了遷移和侵襲，而AEG-1敲除則消除了這種影響，并且發(fā)現(xiàn)在AEG-1敲低細(xì)胞中MMP-9分泌和表達(dá)降低。崔戈等[27]構(gòu)建了BAMBl過表達(dá)融合紅色熒光慢病毒載體感染結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株，移植入肝臟特異性綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（Apo14：GFP）胚胎，通過熒光顯微系統(tǒng)觀察到結(jié)腸癌細(xì)胞在斑馬魚肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)BAMBl基因過表達(dá)可顯著促進(jìn)活體結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，因此成功建立了一種基因修飾的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移斑馬魚模型，為開發(fā)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移治療提供了一種新型的動物活體研究模型。

2.6 其他腫瘤斑馬魚模型

眾所周知，斑馬魚是糖尿病和胰腺癌最好的模式生物。Schiavone等[28]為了鑒定調(diào)節(jié)侵襲性標(biāo)志的候選分子（Notch和TGFβ）對胰腺癌的發(fā)病和進(jìn)展情況，建立了斑馬魚胰腺癌模型，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的發(fā)病期間Notch信號傳導(dǎo)途徑上調(diào)，然后上調(diào)TGFβ/Smad3通路。Ignatius等[29]使用KrasG12D驅(qū)動的胚胎性橫紋肌肉瘤模型（ERMS）的研究，強(qiáng)調(diào)起源細(xì)胞作為ERMS決定因素的重要性。使用轉(zhuǎn)基因rag2-KrasG12D模型的動態(tài)細(xì)胞成像來追蹤胚胎和成年斑馬魚中ERMS細(xì)胞亞群的進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)并揭示了分化的ERMS細(xì)胞在腫瘤生長中的新作用，并表明控制其穩(wěn)態(tài)維持調(diào)節(jié)生長中的機(jī)制可能是開發(fā)潛在治療方法的相關(guān)考慮因素。用類似的模型，Storer等[30]使用代表肌肉發(fā)育的各個階段的啟動子（cdh15、rag2、mylz2），推動KrasG12D的表達(dá)，并觀察到源自更多祖細(xì)胞樣細(xì)胞的腫瘤更具侵襲性。并發(fā)現(xiàn)這些腫瘤基于分化狀態(tài)概括了人ERMS的亞組，并且在每個亞組中具有獨(dú)特的信號傳導(dǎo)途徑。這些途徑作為治療靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究，利用跨物種基因組學(xué)來指導(dǎo)治療靶向的策略具有重要意義。

3 結(jié)語

雖然斑馬魚在腫瘤研究領(lǐng)域仍然相對不成熟，但其在體內(nèi)成像、遺傳易處理性和藥理學(xué)測試的順從性等特性為研究人員研究驅(qū)動腫瘤形成和腫瘤發(fā)展機(jī)制提供了獨(dú)特的優(yōu)勢，為重大研究發(fā)現(xiàn)提供了新的途徑，并為治療開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了模型系統(tǒng)。斑馬魚模型有望為腫瘤生物學(xué)和癌癥藥物開發(fā)做出巨大貢獻(xiàn)。

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（收稿日期：2018-07-30 本文編輯：任 念）