楊燕　王德龍　郭靜　石天宇　屈媛媛　王月　孫維伯　楊添淞

[摘要] 目的 觀察頭部電針對(duì)復(fù)合因素刺激所致慢性疲勞綜合征大鼠的行為學(xué)改變和海馬、下丘腦組織形態(tài)學(xué)改變的影響。 方法 選取SD大鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和針刺組，每組各12只。模型組和針刺組采用復(fù)合因素刺激的方法建立慢性疲勞綜合征模型，針刺組電針百會(huì)、寧神、雙側(cè)感覺區(qū)，觀察大鼠在曠場(chǎng)中的活動(dòng)情況和大鼠海馬、下丘腦組織形態(tài)變化情況。 結(jié)果 治療前，與正常組比較，模型組和針刺組大鼠的水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)明顯減少（P < 0.01）；治療后，與模型組比較，針刺組大鼠的水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)明顯增多（P < 0.01）。HE染色顯示，治療前，與正常組比較，模型組和針刺組大鼠海馬、下丘腦神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)形態(tài)上和數(shù)量上的病理改變，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，毛細(xì)血管水腫；治療后，與模型組比較，針刺組大鼠海馬、下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的病理改變有所改善。 結(jié)論 頭部電針可以明顯改善慢性疲勞綜合征模型大鼠的中樞性疲勞狀態(tài)，該作用機(jī)制可能與電針對(duì)海馬、下丘腦神經(jīng)元的修復(fù)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 電針；慢性疲勞綜合征；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；下丘腦；海馬

[中圖分類號(hào)] R255.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）09（b）-0009-04

[Abstract] Objective To observe the effect of head electroacupuncture on behavioral changes and morphological changes of hippocampus and hypothalamus in rats with chronic fatigue syndrome induced by composite factors stimulation. Methods Thirty-six SD rats were selected and divided into the normal group， the model group and the acupuncture group by random number table， with 12 rats in each group. The model group and the acupuncture group used the composite factors stimulation to establish the chronic fatigue syndrome model. The acupuncture group was treated with electroacupuncture of baihui， ningshen and bilateral sensory areas to observe the activity of rats in the open field and the changes of tissue morphology in hippocampus and hypothalamus of the rats. Results Before treatment， the horizontal activity and vertical activity of the rats in the model group and the acupuncture group were significantly reduced compared with the normal group （P < 0.01）. After treatment， the horizontal activity and vertical activity of the rats in the acupuncture group were significantly increased （P < 0.01）. HE staining showed that the hippocampus and hypothalamus neurons in the model group and the acupuncture group showed morphological and quantitative pathological changes before treatment. The number of apoptotic cells and capillary edema was increased in the model group and the acupuncture group. The pathological changes in the hippocampus and the hypothalamus of the rats in the acupuncture group were improved after treatment. Conclusion Head electroacupuncture can obviously improve the central fatigue state of model rats with chronic fatigue syndrome， which may be related to the repair of neurons in the hippocampus and hypothalamus by electroacupuncture.

[Key words] Electroacupuncture； Chronic fatigue syndrome； Open field test； Hypothalamus； Hippocampus

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一種復(fù)雜的難治性疾病，以慢性虛弱性疲勞為特征，常在用力后加重，經(jīng)充分休息不能緩解、病程進(jìn)展緩慢，遷延不愈，其常見伴隨癥狀有肌肉酸痛、咽喉腫痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)不利等軀體感覺不適，以及抑郁、焦慮、睡眠障礙等精神異常[1]。目前關(guān)于本病的病因病機(jī)、診斷和治療均不明確，其發(fā)病機(jī)制可能與神經(jīng)、免疫、精神等因素相關(guān)[2-4]。中醫(yī)認(rèn)為本病與五臟功能虛損、氣血陰陽不足有關(guān)，臨床上針刺對(duì)于本病的治療具有顯著療效[5]。本研究通過觀察電針大鼠百會(huì)、寧神、雙側(cè)感覺區(qū)對(duì)大鼠行為學(xué)及下丘腦、海馬形態(tài)的影響，進(jìn)一步闡明電針治療CFS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔SD大鼠36只，體重180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK黑2008-004。

1.1.2 儀器 6805-Ⅱ電針儀（常州市武進(jìn)長(zhǎng)城醫(yī)療器械有限公司）；攝像機(jī)（HDR-PJ200，日本索尼公司）；曠場(chǎng)箱（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心自制）；2135型切片機(jī)（德國(guó)菜卡）；moticam3000顯微攝影系統(tǒng)（美國(guó)motic）；電熱恒溫箱（上海一恒）；大鼠聲光電刺激實(shí)驗(yàn)裝置（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心自制）；TES-1350A型噪音機(jī)（臺(tái)灣泰仕）。

1.2 方法

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將36只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和針刺組，每組各12只。根據(jù)CFS多因素致病的特征，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]采用復(fù)合因素刺激的方式對(duì)模型組和針刺組進(jìn)行造模，正常組常規(guī)飼養(yǎng)，不做處理。造模成功標(biāo)準(zhǔn)參考高懷林等[9]疲勞評(píng)分量表，即動(dòng)物出現(xiàn)精神倦怠，嗜臥，皮毛稀疏失去光澤，眼神黯淡無光，身體逐漸消瘦，自主活動(dòng)明顯減少，瞇眼明顯，糞便稀，反應(yīng)力明顯降低，則說明造模成功。

1.2.1 負(fù)重力竭游泳 正式造模前，先將大鼠置于深35 cm的水池中[水溫（25±2）℃]適應(yīng)性游泳3 d，每日1次，每次游泳20 min。適應(yīng)后，將大鼠負(fù)重自身體重5%的重物，游泳至力竭，每日1次，連續(xù)游泳28 d。

1.2.2 慢性應(yīng)激刺激 大鼠力竭游泳后給予包括禁水12 h、禁食12 h、通宵照明、夾尾（1 min）、噪聲刺激（110 dB，1 h）的不可預(yù)知的應(yīng)激刺激，以上刺激每天隨機(jī)給予2種，以避免適應(yīng)發(fā)生。

1.3 電針干預(yù)

造模成功后，對(duì)針刺組進(jìn)行電針治療。選穴：百會(huì)、寧神、雙側(cè)感覺區(qū)，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜取穴。針具：0.35 mm×25 mm安迪牌針灸針。治療方法：于大鼠針刺部位常規(guī)剪毛消毒，用毫針在百會(huì)、寧神、感覺區(qū)（雙）處快速刺入皮下15 mm，接6805-Ⅱ電針儀調(diào)至連續(xù)波，電針治療每日1次，每次30 min，連續(xù)治療15 d，正常組和模型組不給予任何治療，模型組每天給予針刺組相同時(shí)間捆綁，排除由針刺時(shí)捆綁造成的誤差。

1.4 一般情況觀察

造模和治療期間，每天觀察并記錄大鼠的飲水量、進(jìn)食量、體重、大鼠糞便及皮毛色澤、休息時(shí)身體的姿勢(shì)變化等情況。

1.5 行為學(xué)觀察

治療前和治療后分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估，具體操作為：將大鼠依次放入高60 cm、底面100 cm×100 cm的曠場(chǎng)箱中，曠場(chǎng)箱的底面平分為25個(gè)小方格，記錄大鼠在3 min內(nèi)的活動(dòng)情況，包括水平運(yùn)動(dòng)得分（即3 min內(nèi)穿越格子數(shù)）和垂直運(yùn)動(dòng)得分（即后肢站立次數(shù)）。

1.6 病理形態(tài)學(xué)觀察

1.6.1 取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，用4℃生理鹽水經(jīng)心灌注，當(dāng)循環(huán)液體顏色變清時(shí)，換用冷的4%多聚甲醛PBS液繼續(xù)灌注固定，直至大鼠四肢肌肉發(fā)硬僵直，肝、肺逐漸變白停止心臟灌注，斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中備用。

1.6.2 腦組織切片制備 冰盤上將固定好的大鼠腦組織分別取海馬和下丘腦，流水沖洗后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，切片厚5 μm，展片撈起，置于60℃烘箱中12 h，取片進(jìn)行HE染色，并于鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

28 d后，模型組、針刺組大鼠出現(xiàn)體重下降、食量下降、皮毛脫落、瞇眼懶動(dòng)、大便不成形等表現(xiàn)，提示造模成功，通過15 d的治療，與模型組比較，針刺組大鼠飲水、進(jìn)食量基本恢復(fù)正常，精神尚可，皮毛顏色較有光澤，體重有緩慢增長(zhǎng)，自主活動(dòng)增加，糞便均正常。

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

治療前，模型組和針刺組大鼠水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)的次數(shù)均明顯少于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。治療15 d后，針刺組的水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)的次數(shù)均明顯多于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。治療后，針刺組水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)次數(shù)均明顯多于治療前（P < 0.05），而正常組、模型組與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 HE染色結(jié)果

光鏡下觀察，模型組大鼠海馬、下丘腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)欠規(guī)整，胞質(zhì)胞核染色欠清晰；膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目稍增多，凋亡小體數(shù)目增多；神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)疏松，炎癥細(xì)胞數(shù)目明顯增多。與模型組比較，針刺組大鼠海馬、下丘腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列較規(guī)整，胞質(zhì)胞核較清晰，凋亡小體和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目有所減少，毛細(xì)血管水腫程度和炎癥細(xì)胞數(shù)量有所減輕。見圖1。

3 討論

目前，對(duì)CFS的發(fā)病機(jī)制研究尚未闡釋清楚，但有研究表明，CFS常由多重因素共同致病[1]。介于發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和臨床表現(xiàn)的多樣性，目前對(duì)于本病研究的動(dòng)物模型制備并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，制備的模型也無法完全模擬CFS的全部癥狀，本研究選用多因素復(fù)合刺激的造模方式，最大限度地模擬了CFS的多重應(yīng)激機(jī)制。

在治療方法上，本研究采用頭針結(jié)合電刺激，可加強(qiáng)針刺作用，更有效地改善大腦功能[11-12]。頭為諸陽之會(huì)，針刺頭部腧穴能激發(fā)人體陽氣，使氣血運(yùn)行通暢，臟腑功能得復(fù)。其中百會(huì)又稱“三陽五會(huì)”匯集手足三陽脈和五臟之精，具有保健強(qiáng)壯、醒神開竅的作用。寧神，位于督脈神庭與印堂中點(diǎn)[13]，解剖位置位于大腦前額葉在體表的投影區(qū)，具有寧心安神、調(diào)節(jié)情志的作用，感覺區(qū)位于運(yùn)動(dòng)區(qū)（運(yùn)動(dòng)區(qū)上點(diǎn)位于前后正中線中點(diǎn)后0.5 cm；下點(diǎn)為眉枕線和鬢角發(fā)際前緣相交處）向后1.5 cm的平行線，解剖位置為中央后回在體表的投影，可緩解肢體疼痛及感覺異常。頭部電針治療復(fù)合因素誘導(dǎo)的CFS大鼠，既能疏通經(jīng)脈，激發(fā)陽氣，醒腦開竅，又能調(diào)節(jié)針刺相對(duì)應(yīng)的額頂葉大腦功能。

本研究過觀察動(dòng)物造模過程中的狀態(tài)變化和在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)情況來反映造模情況和針刺療效。通常大鼠在曠場(chǎng)中的水平運(yùn)動(dòng)得分反映了大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，而垂直運(yùn)動(dòng)得分則反映大鼠對(duì)外界環(huán)境的好奇心和探索能力[14]。本研究中，治療前，模型組和針刺組與正常組比較，垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯減少（P < 0.01），提示大鼠自主活動(dòng)能力下降。治療后，模型組大鼠垂直、水平活動(dòng)次數(shù)與治療前無明顯差異，而針刺組大鼠垂直、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯多于治療前及模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），這提示模型組大鼠自主活動(dòng)能力沒有明顯改善，而針刺治療對(duì)CFS大鼠疲勞狀態(tài)有明顯改善作用。

在CFS的機(jī)制研究方面，神經(jīng)內(nèi)分泌與CFS的關(guān)系已經(jīng)成為了近年來的研究熱點(diǎn)[15]，研究中，大部分集中在下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的調(diào)節(jié)機(jī)制上，CFS患者多存在HPA功能低下[16-17]，表現(xiàn)為HPA軸對(duì)應(yīng)激因素的低敏感性、對(duì)糖皮質(zhì)激素的高敏感性和HPA軸激素的低水平分泌，而下丘腦作為HPA軸功能啟動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其功能狀態(tài)與CFS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。根據(jù)CFS患者表現(xiàn)出的健忘、注意力不集中等精神障礙，可推測(cè)海馬作為學(xué)習(xí)記憶的中樞調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，其病理形態(tài)學(xué)改變可能與CFS 的發(fā)生有關(guān)。本研究對(duì)大鼠海馬、下丘腦進(jìn)行HE染色，探究頭部電針對(duì)海馬、下丘腦病理形態(tài)學(xué)變化的影響，經(jīng)過15 d的治療，與模型組比較，針刺組大鼠海馬及下丘腦HE染色顯示神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改善，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，毛細(xì)血管水腫減輕，提示頭部電針可以減少CFS大鼠海馬和下丘腦區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞病理變化，從而起到緩解疲勞癥狀、改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用。本研究提示針刺可以通過改善CFS大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)而起作用，其分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Fukuda K，Straus SE，Hickie I，et al. The chronic fatigue syndrome：a comprehensive approach to its definition and study [J]. Ann Intern Med，1994，121（12）：953-959.

[2] Brenu EW，van Driel ML，Staines DR，et al. Immunological abnormalities as potential biomarkers in chronic fatigue syndrome/myalgic encephalomyelitis [J]. J Transl Med，2011，28（9）：81.

[3] Meeus M，Nijs J，Van Mol E，et al. Role of psychological aspects in both chronic pain and in daily functioning in chronic fatigue syndrome：a prospective longitudinal study [J]. Clin Rheumatol，2012，31（6）：921-929.

[4] Shan ZY，Kwiatek R，Burnet R，et al. Progressive brain changes in patients with chronic fatigue syndrome：a longitudinal MRI study [J]. J Magn Reson Imaging，2016，44（5）：1301-1311.

[5] 張維，彭唯娜，劉志順.針刺治療慢性疲勞綜合征的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].循證醫(yī)學(xué)，2009，9（1）：41-47.

[6] 呼德爾朝魯，霍得逸，盧莎.單純游泳運(yùn)動(dòng)構(gòu)建慢性疲勞綜合征小鼠模型[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2017，17（A0）：85，89.

[7] 張麗，張振賢，黃瑤，等.不同慢性應(yīng)激綜合模式下慢性疲勞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究概況[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016， 36（8）：1015-1020.

[8] 古春青，王著敏，趙鐸.紅景天對(duì)復(fù)合應(yīng)激因素致慢性疲勞大鼠體重及一般行為學(xué)的影響[J].中國(guó)處方藥，2016， 14（4）：29-30.

[9] 高懷林，吳以嶺，朱慧明，等.慢性疲勞綜合征動(dòng)物模型的建立及對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（12）：904-907.

[10] 李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003.

[11] 時(shí)燁.電針頭穴刺激對(duì)健康人大腦各功能區(qū)變化的fMRI研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[12] 姜思竹.基于靜息態(tài)fMRI和DTI探討頭針治療腦卒中偏癱的機(jī)制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[13] 孫忠人，王玉琳，張瑞，等.針灸醫(yī)案精選[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2012.

[14] 蔡思琪，李沅衡，黎嘉，等.鼠類行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（5）：916-920.

[15] 周全紅，康明祥.慢性疲勞綜合征神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制的研究進(jìn)展[J].西南軍醫(yī)，2010，12（3）：516-518.

[16] 王楊.慢性疲勞綜合征患者HPA軸及5-HT系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制及中西醫(yī)治療進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2016，14（19）：143-146.

[17] Morris G，Anderson G，Maes M. Hypothalamic-pituitary-adrenal hypofunction in myalgic encephalomyelitis（ME）/chronic fatigue syndrome（CFS）as a Consequence of Activated Immune-Inflammatory and Oxidative and Nitrosative Pathways [J]. Mol Neurobiol，2017，54（9）：6806-6819.

[18] 袁權(quán).電針調(diào)整慢性疲勞大鼠HPA軸功能的下丘腦CRH機(jī)制[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

（收稿日期：2018-04-25 本文編輯：張瑜杰）