李春艷，狄 冉，張 彥，任春環(huán)，張子軍，劉秋月，胡文萍, 王翔宇，張效生，張金龍，儲(chǔ)明星*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

大多數(shù)綿羊?qū)儆诩竟?jié)性發(fā)情的一胎單羔品種，僅有少數(shù)綿羊?qū)儆谝惶ザ喔崞贩N且其分布受地域限制[1]，因此，在自然狀態(tài)下很難提升綿羊的產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。隨著現(xiàn)代科技發(fā)展，人們開始利用分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合常規(guī)育種來提升育種效率，主要是通過尋找與綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)的主效基因或遺傳標(biāo)記[2]，以此篩選高繁殖力綿羊群體。目前，研究者主要應(yīng)用基因組學(xué)方法篩選與綿羊繁殖力有關(guān)的候選基因及分子標(biāo)記，并通過全基因組重測序發(fā)掘功能基因以解釋綿羊多羔機(jī)理[3-4]。本課題組前期對多個(gè)綿羊品種的多個(gè)個(gè)體進(jìn)行全基因組重測序并進(jìn)行分組（單羔且季節(jié)性發(fā)情組和多羔且常年發(fā)情組），利用群體分化指數(shù)（Fst）法對多羔組和單羔組分化程度進(jìn)行分析（0＜Fst＜1，值越大表示遺傳分化程度越高）和鑒定選擇信號，從而篩選綿羊多羔相關(guān)基因，定義 Z（Fst）＞5 為顯著位點(diǎn)[5]。其中，利用Fst方法對單、多羔組綿羊進(jìn)行分化程度分析并鑒定選擇信號，結(jié)果篩選到SIX1（Sineoculis Homeobox Homolog 1）基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)。

同源盒基因SIX1為SIX轉(zhuǎn)錄因子家族成員[6]，該基因可與一些輔助因子Eya1、SIX4等共同作用抑制或活化基因表達(dá)[7]，能促進(jìn)動(dòng)物胚胎發(fā)育[8]和細(xì)胞增殖與分化[9]、抑制凋亡[10]等。本研究主要檢測小尾寒羊繁殖組織中SIX1基因表達(dá)特征，并對不同綿羊群體重測序篩選出來的SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，以揭示SIX1基因與綿羊繁殖的關(guān)系，并確認(rèn)該位點(diǎn)突變對產(chǎn)羔數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 qPCR樣品采集 小尾寒羊來自天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)基地。課題組前期挑選2～3歲的健康狀況良好的小尾寒羊，頸靜脈采血后進(jìn)行Taqman分型獲得FecB野生純合型（++）母羊群體，根據(jù)產(chǎn)羔數(shù)記錄（連續(xù)3胎僅產(chǎn)1羔的母羊記為單羔組，連續(xù)3胎均產(chǎn)2羔或2羔以上的母羊記為多羔組）對其進(jìn)行同期發(fā)情處理獲得卵泡期FecB++型（排除FecB基因突變對母羊產(chǎn)羔數(shù)的影響）小尾寒羊6只，單羔組和多羔組各選3只。屠宰綿羊后迅速采集卵巢、輸卵管、子宮體、大腸、小腸、骨骼肌、脂肪、腎臟、臟臟、腎上腺等新鮮組織樣，分別裝入2 mL RNase-Free凍存管后立即置于液氮中暫時(shí)保存。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)存于-80 冰箱。

1.2 RNA提取和cDNA合成 利用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）加Trizol（Invitrogen）提取各組織總RNA，并用Nanodrop 2000檢測所提RNA濃度及OD值，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。質(zhì)檢合格的RNA用于反轉(zhuǎn)錄，通過cDNA快速合成試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作參照試劑盒說明，全程操作在冰上完成。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank提供的綿羊SIX1基因mRNA序列（登錄號：NM_001174113.1），利用Primer 5.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，以β-actin基因（登錄號：NM_001009784）作內(nèi)參。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物具體信息見表1。

1.4 qPCR 根據(jù)課題組前期設(shè)置的qPCR體系和程序[11]，建立和繪制目的基因及持家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測引物擴(kuò)增效率（表1）和熔解曲線（圖略），并進(jìn)行qPCR反應(yīng)以檢測目的基因的相對表達(dá)量。

1.5 分型樣品 分型用的血液DNA樣分別來自多羔的小尾寒羊（407只，采樣前期分別記錄其中380只羊在前3胎中的產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)）、湖羊（101只）、策勒黑羊（52只）和單羔的灘羊（22只）、蘇尼特羊（21只）、草地型藏羊（161只），每個(gè)樣用量為 20 μL，DNA 濃度為 40～80 ng/μL。利用 Sequenom MassARRAY?SNP技 術(shù)[12]對SIX1基 因 g.69738971 T＞G位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量；借助Microsoft Excel 2013計(jì)算SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）及有效等位基因數(shù)（NE），并進(jìn)行Hardy-Weinberg檢測；通過yijkl=μ+LSi+Pj+Gk+eijkl模型進(jìn)行最小二乘方差分析，此模型中：yijkl為產(chǎn)羔數(shù)記錄值、μ為群體平均值、LSi為第i個(gè)產(chǎn)羔季節(jié)的固定效應(yīng)值、Pj為第j個(gè)胎次的固定效應(yīng)值、Gk為SIX1基因第k種基因型的固定效應(yīng)值、eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)值，并利用SPSS 19.0軟件中一般線性模型分析小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性，所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)羔數(shù)小尾寒羊繁殖組織中SIX1基因表達(dá)如圖1所示，卵泡期小尾寒羊的卵巢、子宮體、輸卵管組織中SIX1基因均有表達(dá)；其中，卵巢和輸卵管組織中該基因在單羔組和多羔組之間的表達(dá)差異都不顯著（P＞0.05），單羔組子宮體該基因表達(dá)量顯著高于多羔組（P＜0.05）。

2.2SIX1基因多態(tài)性分析 通過分型發(fā)現(xiàn)綿羊g.69738971 T＞G位點(diǎn)共存在3種基因型，分別是TT、GT和GG（圖2）。

從表2可知，g.69738971 T＞G位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率在單、多羔品種即季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情品種間的差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；在常年發(fā)情的品種中GT基因型占優(yōu)勢，而季節(jié)性發(fā)情品種中GG基因型占優(yōu)勢；在高、低繁殖性能的綿羊品種中G等位基因均占優(yōu)勢。

表1 熒光定量引物信息

圖1 不同產(chǎn)羔數(shù)小尾寒羊繁殖組織中SIX1基因表達(dá)

圖2 SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)分型結(jié)果

表2 SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)在單、多羔綿羊（高、低繁殖性能）品種中的基因型頻率和等位基因頻率

由表3可知，SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)在單羔灘羊、草地型藏羊和多羔小尾寒羊、湖羊及策勒黑羊群體中均呈現(xiàn)中度多態(tài)（0.25≤PIC＜0.5），而在單羔的蘇尼特羊群體中呈低度多態(tài)（PIC＜0.25）；卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明該位點(diǎn)在單、多羔綿羊群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.3SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系 由表4可知，g.69738971 T＞G位點(diǎn)野生型（TT）的各胎次產(chǎn)羔數(shù)顯著（P＜0.05）高于突變型(GT和 GG)。

3 討 論

綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)基因篩選對闡釋其產(chǎn)羔分子機(jī)制有重要意義，目前在綿羊群體中尋找多羔基因的工作亦屬于綿羊分子遺傳育種方面的一個(gè)熱點(diǎn)，但在我國本土綿羊中被發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)羔相關(guān)的候選基因并不多[13]。本研究通過對綿羊全基因組重測序篩選到SIX1基因，并發(fā)現(xiàn)其Fst值在單、多羔綿羊群體間的差異達(dá)顯著水平，推測其可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)。

3.1SIX1基因表達(dá)分析 早期研究發(fā)現(xiàn)SIX1基因在脊椎動(dòng)物眼[14]、耳[15]、腎[16]、骨骼肌[17]等組織中均有表達(dá)。Soay綿羊垂體結(jié)節(jié)部SIX1基因表達(dá)與發(fā)情誘導(dǎo)因子Eya3、TSHβ等有關(guān)[7,18]，所形成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體可導(dǎo)致HPGA系統(tǒng)性激素分泌變化，從而調(diào)控綿羊發(fā)情和繁殖[19]，提示SIX1基因表達(dá)與綿羊繁殖有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，SIX1基因在小尾寒羊繁殖組織（卵巢、輸卵管、子宮體）中均表達(dá)，且單羔組的子宮體中SIX1基因表達(dá)量顯著高于多羔組，進(jìn)一步驗(yàn)證了SIX1基因與綿羊繁殖相關(guān)，推測該基因可能與子宮中孕體著床、胎兒發(fā)育等有關(guān)。

3.2SIX1基因與綿羊繁殖性狀的關(guān)系 目前為止，未見該基因多態(tài)與動(dòng)物繁殖性能關(guān)聯(lián)的報(bào)道。本研究中，在綿羊SIX1基因g.69738971 T＞G突變位點(diǎn)上，在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、灘羊及草地型藏羊共743只中均檢測到TT、GT、GG 3種基因型，且其位點(diǎn)在這些綿羊群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25≤PIC＜0.5）；而該突變位點(diǎn)在蘇尼特羊（共21只）中僅檢測到GT和GG共2種基因型，并表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25）。這可能與本研究所選擇的綿羊尤其是蘇尼特羊數(shù)量較少有關(guān)，也可能是由于品種間的差異造成。另外，g.69738971 T＞G位點(diǎn)在各綿羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)表明該突變位點(diǎn)可以穩(wěn)定遺傳。SIX1基因g.69738971 T＞G屬于內(nèi)含子突變，但該突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在季節(jié)性發(fā)情綿羊品種和常年發(fā)情綿羊品種間均存在極顯著差異，且該突變使小尾寒羊群體中母羊的產(chǎn)羔數(shù)有減弱趨勢，即野生型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于突變型。以上結(jié)果表明，SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)突變與發(fā)情季節(jié)性和產(chǎn)羔數(shù)存在一定關(guān)聯(lián)，有作為調(diào)控綿羊繁殖性狀分子標(biāo)記的潛力。

表3 不同品種綿羊中SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)的遺傳學(xué)分析

表4 SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果提示，SIX1基因在小尾寒羊繁殖組織中表達(dá)，且單羔組子宮體中SIX1基因表達(dá)量顯著高于多羔組。SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)突變與綿羊發(fā)情季節(jié)性極顯著相關(guān)，且其與產(chǎn)羔數(shù)存在一定程度的負(fù)相關(guān)。因此，SIX1基因g.69738971 T＞G位點(diǎn)突變可作為調(diào)控綿羊繁殖性狀的候選基因位點(diǎn)用于分子標(biāo)記輔助選育。