胡忠昌，曹 陽，吳 健，金海國，趙玉民*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學院畜牧科學分院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學農(nóng)學院，吉林延邊 133002）

延黃牛是我國經(jīng)過27年選育而成的優(yōu)秀肉牛品種，具有適應(yīng)性強、生長速度快、產(chǎn)肉率高等優(yōu)點，是具有鮮明地域特點和朝鮮族特色的高檔肉牛品種[1-2]。

乙醛脫氫酶1A1（Acetaldehyde Dehydrogenase 1A1，ALDH1A1）為乙醛脫氫酶（ALDHs）基因超家族成員之一，該基因位于人的第19號染色體的長臂21區(qū)31亞區(qū)，主要存在于肝臟[3]、晶狀體[4]、腦組織、視網(wǎng)膜[5]和胃腸道黏膜上[6]。據(jù)統(tǒng)計，ALDH1A1基因的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為54.86 ku，推測總原子數(shù)目達到7 700個，而半衰期可達到30 h，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是親水性蛋白質(zhì)，其不穩(wěn)定系數(shù)小于30，平均疏水性值約為-0.16[7-8]。在動物肝臟中ALDHs能將醇類化合物氧化成對應(yīng)的醛類[9]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1基因可以通過調(diào)控視黃醛信號通路的升高而促進葡萄糖和脂質(zhì)的氧化。Park等[11]在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)沉默ALDH1A1基因能使視黃醛毒性在癌癥細胞中減少。ALDH1A1基因在脂肪細胞分泌調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用，能夠通過交感神經(jīng)元促進白色脂肪組織的生長和神經(jīng)支配，且顯著刺激體內(nèi)和體外軸突神經(jīng)的生長[12-13]。目前，關(guān)于ALDH1A1基因的研究還局限于人類癌癥方面，而作為重要的脂肪酸代謝調(diào)控基因，在尋找可行性遺傳標記SNP位點方面至今還未見報道。鑒于此，本研究以16月齡延黃牛母牛為實驗對象，利用Sanger直接測序的方法檢測ALDH1A1基因多態(tài)性，分析其與延黃牛體尺、肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性，為開展延黃牛肉質(zhì)候選基因篩選的工作提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機抽取16月齡的99頭延黃牛母牛（吉林省琿春市吉興牧業(yè)有限公司提供），采集延黃牛耳組織約1.5 g，放入含有75 %乙醇的2 mL離心管中，標記好牛號和時間帶回實驗室提取DNA。

1.2 主要試劑及儀器 AxyPrep基因組DNA提取試劑盒購自Axygeno公司，2XES Taq MasterMix購自CWBIO公司，超微量分光光度計Quawell-Q5000購自北京鼎盛生物技術(shù)有限責任公司，PCR儀T100購自上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司。

1.3 基因組DNA的提取 根據(jù)AxyPrep基因組DNA提取試劑盒說明書提取99頭延黃牛牛耳組織基因組DNA，采用Quawell-Q5000超微量分光光度計檢測DNA的濃度及純度，并取3 μL進行電泳定性檢測DNA。

1.4 DNA引物設(shè)計及合成 根據(jù) GenBank 中發(fā)表的牛ALDH1A1基因DNA序列（登錄號：NW_003104101.1），通過UCSC查找基因外顯子，共發(fā)現(xiàn)ALDH1A1基因含有13個外顯子，用Primer5.0設(shè)計引物，引物信息見表1。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 PCR反應(yīng)體系及條件 PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq Master Mix10 μL，DNA 1 μL， 上、 下 游 引 物 各 0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 預變性2 min；95變性30 s；退火（見表1）30 s，72 延伸30 s，共34個循環(huán)；72 終延伸5 min，產(chǎn)物4 保存。

1.6 延黃牛ALDH1A1基因多態(tài)性檢測 對99頭延黃牛DNA樣品進行PCR擴增，每個取 3 μL進行電泳檢測，剩余PCR產(chǎn)物由蘇州金唯智生物科技有限公司Sanger直接測序。利用DNAman軟件對測序結(jié)果逐一進行分析尋找SNP位點，用Chromas對測序結(jié)果波峰圖進行分析，統(tǒng)計并計算基因型和基因型頻率。

1.7 統(tǒng)計分析 利用 SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，以確定單個基因型與肉用性狀的相關(guān)性。結(jié)果以平均值±標準差表示，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準。1.8 基因（型）頻率及遺傳多態(tài)性統(tǒng)計分析 通過基因（型）頻率計算遺傳純合度（Ho）、遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）。

表1 引物序列信息

式中，n為等位基因數(shù)；Pi、Pj為第i、j個等位基因頻率。PIC＜0.25為低度多態(tài)；PIC＞0.5為高度多態(tài)；0.25＜PIC＜0.5為中度多態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 延黃牛ALDH1A1基因PCR擴增 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1基因第4外顯子片段長度約為443 bp，與預期擴增片段大小一致（圖1）。

圖1 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 序列分析 對測序結(jié)果的分析比對發(fā)現(xiàn)，僅在ALDH1A1基因第4外顯子編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)G/T突變，其余外顯子未發(fā)現(xiàn)突變（圖2），利用Chromas軟件對測序結(jié)果波峰圖依次比對確定ALDH1A1基因第4外顯子基因型，與 GenBank（登錄號：NW_003104101.1）序列反向互補相同序列的定義為TT基因型，雜合子為TG基因型，未發(fā)現(xiàn)GG基因型（圖3）。該突變導致氨基酸酪氨酸（Y）發(fā)生改變（圖4）。

2.3 延黃牛ALDH1A1基因遺傳學分析 對ALDH1A1基因第4外顯子TT和TG基因型進行分析發(fā)現(xiàn)，TT和TG的基因型頻率分別為79.80 %和20.20 %，TT為優(yōu)勢基因型；T和G基因頻率分別為89.9 %和10.1 %，T為優(yōu)勢等位基因（表2）。由表3可知，ALDH1A1基因第4外顯子T/G突變位點的He相對較低，表明其在延黃牛群體中的變異較??；PIC為0.166（PIC＜0.25），表現(xiàn)為低度多態(tài)，說明上述遺傳標記能夠提供少量的遺傳信息。

圖2 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子序列比對結(jié)果

圖3 TT和TG的測序波峰圖

圖4 ALDH1A1基因第4外顯子氨基酸序列與原氨基酸序列比對圖

表2 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子基因型頻率及其基因頻率

表3 ALDH1A1基因4號外顯子在延黃牛上的遺傳特性

2.4 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與體尺、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析 如表4所示，ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與延黃牛體尺性狀中的十字部高、胸圍、腹圍和管圍存在顯著相關(guān)（P＜0.05），與肉質(zhì)性狀中的背膘厚存在顯著相關(guān)（P＜0.05），與肌內(nèi)脂肪具有一定的相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討 論

乙醛脫氫酶超家族（ALDHs）可以通過編碼一類NAD（P）+依賴的酶，將外源性和內(nèi)源性的醛類脂肪族和醛類芳香族氧化為相應(yīng)的羧酸[14]。ALDH1A1作為該家族中的重要一員，在視黃醛代謝和維甲酸代謝通路的活化中發(fā)揮著重要的作用，還是脂類代謝通路的關(guān)鍵基因。本研究在延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子處發(fā)現(xiàn)T/G突變，TT為優(yōu)勢基因型（79.80%），T為優(yōu)勢等位基因（89.90%），該位點的突變引起氨基酸Y（酪氨酸）的改變，而酪氨酸是一種非必需氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要氨基酸，即參與生糖反應(yīng)也參與生酮反應(yīng)，推測TT基因型可能是影響延黃牛脂肪酸代謝的關(guān)鍵基因型。但是該突變位點的He相對較低，表明其在延黃牛群體中的變異較小；PIC為0.166（PIC＜0.25），表現(xiàn)為低度多態(tài)，說明該遺傳標記能夠提供少量的遺傳信息[15]。TT基因型是否是影響延黃牛脂肪酸代謝的關(guān)鍵基因型，還需要進一步擴大樣本數(shù)量進行系統(tǒng)的分析。通過對ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與延黃牛體尺和肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與延黃牛體尺性狀中的十字部高、胸圍、腹圍和管官圍存在顯著相關(guān)，與肉質(zhì)性狀中的背膘厚存在顯著相關(guān)，與肌內(nèi)脂肪具有一定的相關(guān)性。Gagaoua等[16]通過反相蛋白陣列（RPPA）定量了29個蛋白質(zhì)生物標志物，發(fā)現(xiàn)ALDH1A1基因與牛肉質(zhì)鮮嫩和多汁有關(guān)，并被證實為牛肉質(zhì)的主要生物標志物。Moreb等[17]采用寡核苷酸微陣列分析的方法對肺癌細胞系中基因譜的變化進行分析，發(fā)現(xiàn)ALDH1A1基因與脂質(zhì)代謝、細胞增殖、遷移和粘附有關(guān)。更有學者通過研究小鼠和人細胞發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1和ALDH1A3是癌癥干細胞（CSC）和正常組織干細胞（SC）的標志物，并且參與細胞的自我更新、自我分化和自我保護[18]。ALDH1A1基因第4外顯子多態(tài)性是否對延黃牛體尺和肉質(zhì)性狀有影響，是否能作為一個肉質(zhì)改良的標記，還需要進一步深入研究。本課題組下一步將驗證該基因是否對延黃牛皮下脂肪細胞有影響。

表4 延黃牛ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析結(jié)果

目前，ALDH1A1的研究只局限于人類癌癥[19]、代謝性疾病和神經(jīng)性疾病[20]方面，對脂肪酸代謝、視黃醛代謝和維甲酸代謝通路的影響尚未深入研究。本研究通過對延黃牛ALDH1A1基因多態(tài)性進行檢測及其與延黃牛肉用性狀的關(guān)聯(lián)分析，為今后延黃牛肉質(zhì)改良有效遺傳標記的篩選提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究對延黃牛ALDH1A1基因13個外顯子進行SNP位點檢測，經(jīng)分析在第4外顯子處檢測到T/G突變，且引起編碼氨基酸的改變，但該突變位點的He相對較低，在延黃牛群體中的變異較小，屬于低度多態(tài)（PIC＜0.25），僅能提供少量遺傳信息。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，ALDH1A1基因第4外顯子不同基因型與延黃牛體尺性狀中的十字部高、胸圍、腹圍和管圍存在顯著相關(guān)，與肉質(zhì)性狀中的背膘厚存在顯著相關(guān)，與肌內(nèi)脂肪具有一定的相關(guān)性。綜上所述，ALDH1A1基因外顯子在延黃牛中存在多態(tài)性，且與延黃牛體尺和部分肉質(zhì)性狀存在顯著性差異，能否作為延黃牛肉質(zhì)和體尺性狀的遺傳標記有待于擴大樣本數(shù)量進一步驗證。