王茂輝 鐘春燕 羅文龍 聶金泉 郭 濤 王 慧 陳志強(qiáng)

（1廣東省肇慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，肇慶526000；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣州510000；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣州510642）

一般來說斑點(diǎn)葉突變體是指植物在未遭受病原物侵染或明顯逆境條件下，在植株葉片上自發(fā)形成壞死斑的一類葉色突變體[1]。水稻斑點(diǎn)葉突變體的鑒定主要是通過對變異表型的觀察，突變體的主要特征是葉片或葉鞘上出現(xiàn)不同顏色、大小和形狀的斑點(diǎn)。水稻葉片出現(xiàn)的斑點(diǎn)顏色大多為褐色，也有些突變?yōu)榧t褐色、暗褐色、橙黃色和白色[2]。斑點(diǎn)葉基因作用十分廣泛，涉及很多生理生化過程，一般包括生長、發(fā)育、衰老和死亡等。已鑒定的水稻斑點(diǎn)葉突變體，大多數(shù)由細(xì)胞死亡引起斑點(diǎn)表型，而僅有spl30[3]是非細(xì)胞死亡型斑點(diǎn)葉突變體。由于類病變表型與病原菌侵染后的超敏反應(yīng)癥狀類似，因此斑點(diǎn)葉突變體成為了研究細(xì)胞程序性死亡（PCD，Programmed cell death）和防衛(wèi)反應(yīng)的理想材料[4]。由于活性氧（ROS，Reactive oxygen species）和活性氮（RNS，Reactive nitrogen species）是植物響應(yīng)生物和非生物脅迫的信號分子，能激活防御基因和誘導(dǎo)PCD，因此引起ROS和RNS失衡的基因突變都可能造成局部細(xì)胞死亡，這也是產(chǎn)生斑點(diǎn)葉變異常見的分子機(jī)制[5]。許多斑點(diǎn)葉突變體都伴隨抗病性提高及抗病反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)的組成性表達(dá)，如胼胝質(zhì)的積累、防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的激活、水楊酸含量升高。

突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料，近年來，利用水稻突變體進(jìn)行水稻功能基因組學(xué)研究取得重大進(jìn)展[6-7]。發(fā)掘和鑒定各式各樣的水稻斑點(diǎn)葉突變體，不僅有助于葉綠素合成與降解途徑及光合作用機(jī)理的研究，還有助于水稻品種改良和抗病性研究。本研究前期獲得了一個(gè)自發(fā)突變的斑點(diǎn)葉突變體，進(jìn)而對突變體Spl34其他農(nóng)藝性狀進(jìn)行鑒定，包括田間表型、生理生化指標(biāo)、稻米品質(zhì)及對光合作用的影響等方面，為進(jìn)一步摸清突變體Spl34的生物學(xué)效應(yīng)和今后的育種利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 斑點(diǎn)葉突變體Spl34是從正常綠葉品種粵晶絲苗2號和H4的F2群體中獲得的自然突變體，連續(xù)多代種植后其突變表型穩(wěn)定遺傳。在前期研究的基礎(chǔ)上，以F8突變體Spl34單株分離的無斑點(diǎn)植株（CK）為對照，對突變體Spl34進(jìn)行農(nóng)藝及品質(zhì)性狀、種子活力、生理生化指標(biāo)等研究。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 突變體Spl34田間表型及農(nóng)藝性狀 2016年早季，將突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK）種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，分蘗期觀察田間條件下突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK）的株高、葉片的生長情況；成熟期比較植株、稻穗、籽粒的表型差異及葉斑發(fā)生情況，并對株高、單株穗重、一次枝梗數(shù)、穗長、結(jié)實(shí)率、粒長、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2 種子活力及米質(zhì)分析 種子活力分析是從每個(gè)材料篩選后的種子中隨機(jī)取300粒，分成3組，分別放在鋪有濕紙的發(fā)芽盒中，置于恒溫箱保持適宜溫度30℃，一般3~4d計(jì)算發(fā)芽勢、6~7d計(jì)算發(fā)芽率。米質(zhì)分析是對突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK）的種子進(jìn)行稻米品質(zhì)分析，測定糙米率、精米率、整精米率、堊白粒率、粒長、粒寬。

1.2.3 突變體Spl34對紫外光的反應(yīng) 前期葉片局部遮光試驗(yàn)表明自然光是誘導(dǎo)斑點(diǎn)出現(xiàn)的因素。紫外光是電磁波譜中波長從0.01~0.40μm輻射的總稱，又是自然光中最重要的誘變因素，因此為了探究斑點(diǎn)的出現(xiàn)是否由紫外光引起，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了紫外光處理試驗(yàn)。通過紫外光（UV）處理試驗(yàn)探究突變體Spl34對紫外光（UV）的反應(yīng)，設(shè)置4個(gè)環(huán)境（A：-UV、8h光 照；B：-UV、12h光 照；C：+UV、8h光照；D：+UV、12h光照），放入相同長勢的突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK），觀察植株生長情況及斑點(diǎn)的發(fā)生情況，記錄斑點(diǎn)大小并在斑點(diǎn)出現(xiàn)和爆發(fā)時(shí)拍照。

1.2.4 突變體Spl34的SPAD和可溶性蛋白測定SPAD（SPAD，Soil and plant analyzer development）是作物分析儀，SPAD值可以用來衡量葉片的綠色程度。本研究使用美能達(dá)葉綠素計(jì)SPAD-502（日本大阪美能達(dá)相機(jī)有限公司）測定植株葉片的SPAD值。田間條件下，在水稻開花后選取長勢相對一致的10個(gè)單株，每株測定具有代表性的5片劍葉，每個(gè)葉片重復(fù)測3次。植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，其含量是了解植物總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。田間條件下，在水稻開花后選取長勢相對一致的5個(gè)單株，每株選取具有代表性的3片劍葉，混合作為可溶性蛋白提取的樣本材料，使用牛血清蛋白法測定[8]。

1.2.5 突變體Spl34光合速率測定 為了解突變體Spl34的斑點(diǎn)是否影響水稻葉片的光合作用，在田間測量了開花期突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK）的各項(xiàng)光合作用指標(biāo)。田間條件下，在開花期晴天上午9：00~11：00，取長勢相對一致的突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK）各10株，利用Li-6400XT型便攜式光合作用測定儀分別測定突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK）葉片的各項(xiàng)光合作用指標(biāo)。每株測定具有代表性的5片劍葉，每葉重復(fù)測定3次；測量時(shí)，使用紅、藍(lán)光源，光強(qiáng)恒定為 1200μmol/m2·s，溫度為30℃，CO2濃度為空氣中的濃度，濕度為大氣中的濕度[9]。

1.2.6 突變體Spl34中H2O2和的檢測 在突變體Spl34中斑點(diǎn)的形成一般與ROS（主要是和H2O2）和自由基（主要是OH-）有關(guān)。二氨基聯(lián)苯胺（DAB，3，3′-Diaminobenzidine）被過氧化氫（H2O2）氧化生成不溶于水的暗棕色顆粒（紅棕色沉淀），四唑氮藍(lán)（NBT，Nitro blue tetrazolium）與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)并形成深藍(lán)色不溶性甲瓚化合物，因此DAB和NBT可分別用于檢測H2O2和。突變體Spl34的斑點(diǎn)表型出現(xiàn)后，取突變體Spl34有斑點(diǎn)表型和無斑點(diǎn)植株（CK）的葉片，分別采用DAB、NBT檢測葉片中斑點(diǎn)部位H2O2、的沉積情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體Spl34表型及農(nóng)藝性狀鑒定 調(diào)查早季突變體Spl34植株田間生長情況，分蘗期調(diào)查發(fā)現(xiàn)田間種植的突變體Spl34與無斑點(diǎn)植株（CK）的株高和葉片生長情況沒有差異（圖1）。突變體Spl34的斑點(diǎn)從幼穗分化期開始一直持續(xù)到成熟期，屬于全生育期擴(kuò)散型斑點(diǎn)葉突變體；田間觀察發(fā)現(xiàn)突變體Spl34植株在成熟期沒有出現(xiàn)明顯的早衰現(xiàn)象（圖2a）；突變體Spl34成熟期葉片斑點(diǎn)擴(kuò)散到了整個(gè)葉片（圖2b）；突變體Spl34成熟期的稻穗、籽粒與無斑點(diǎn)植株（CK）沒有明顯差異（圖2c、d）。結(jié)果表明，斑點(diǎn)葉突變體Spl34成熟期植株、稻穗、籽粒的表型性狀與無斑點(diǎn)植株（CK）相比均未出現(xiàn)差異。

圖1 分蘗期無斑點(diǎn)植株（CK）與突變體Spl34的表型

圖2 成熟期無斑點(diǎn)植株（CK）與突變體Spl34的表型

對突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK）的株高、單株穗重、一次枝梗數(shù)、穗長、結(jié)實(shí)率、粒長、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀調(diào)查后，利用SAS（Statistical analysis system）生物統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果顯示突變體Spl34與無斑點(diǎn)植株（CK）相比，各性狀差異不顯著（表1）。表明突變體Spl34的主要農(nóng)藝性狀未受到斑點(diǎn)性狀的不利影響。

2.2 種子活力及品質(zhì)分析 種子活力測定試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體Spl34的發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別達(dá)到了 82.67%、91.33%，而無斑點(diǎn)植株（CK）分別為69.30%、79.60%（圖 3）。突變體Spl34的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均高于無斑點(diǎn)植株（CK），差異達(dá)到極顯著水平。結(jié)果表明，突變體Spl34斑點(diǎn)表型的出現(xiàn)并未影響種子的活力，反而在一定程度上提高了突變體Spl34的種子活力。

表1 突變體Spl34與無斑點(diǎn)植株（CK）農(nóng)藝性狀鑒定

圖3 突變體無斑點(diǎn)植株（CK）與突變體Spl34的種子活力鑒定

利用SAS軟件分析突變體Spl34和無斑點(diǎn)植株（CK）的稻米品質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，突變體Spl34糙米率為84.00%，精米率為72.10%，堊白粒率為10.75%，均與無斑點(diǎn)植株（CK）沒有明顯差異，而突變體Spl34整精米率為66.25%，高于無斑點(diǎn)植株（CK），兩者差異達(dá)極顯著水平（表2）。表明突變體Spl34稻米品質(zhì)未受到斑點(diǎn)性狀的不利影響。

表2 突變體Spl34與無斑點(diǎn)植株（CK）稻米品質(zhì)鑒定

2.3 突變體Spl34對紫外光的反應(yīng) 紫外光（UV）輻照試驗(yàn)顯示：培養(yǎng)箱種植的植株，觀察發(fā)現(xiàn)突變體Spl34在輻照條件下16d葉尖開始出現(xiàn)斑點(diǎn)，而沒有輻照條件的葉尖則未出現(xiàn)斑點(diǎn)。對成熟期葉片斑點(diǎn)面積進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)輻照12h的突變體Spl34的葉片同樣大小區(qū)域內(nèi)（1cm2）斑點(diǎn)面積比輻照8h的要大（圖4）。此外，沒有輻照8h、12h條件下的培養(yǎng)箱中突變體Spl34的葉片均未出現(xiàn)斑點(diǎn)。因此可以推測紫外光（UV）是誘導(dǎo)斑點(diǎn)出現(xiàn)的因素，并且隨著照射時(shí)間的增加斑點(diǎn)面積也會(huì)變大，推測突變體Spl34的斑點(diǎn)可能是紫外光誘導(dǎo)某種未知色素的積累導(dǎo)致。

圖4 UV對突變體Spl34的影響

2.4 SPAD和可溶性蛋白含量測定 SPAD測定結(jié)果顯示，從開花期開始突變體Spl34的SPAD值就低于無斑點(diǎn)植株（CK），其下降速度也較快，開花30d時(shí)突變體Spl34的SPAD值遠(yuǎn)低于無斑點(diǎn)植株（CK）（圖5a）。在開花期開始時(shí)突變體Spl34的SPAD值為36.90，隨著開花時(shí)間的推移SPAD值下降很快，開花30d時(shí)已經(jīng)降至9.81；而無斑點(diǎn)植株（CK）的SPAD值在開花10d后開始明顯下降，30d時(shí)降至25.01。

在開花期突變體Spl34葉片的可溶性蛋白含量均低于無斑點(diǎn)植株（CK），且突變體Spl34葉片的可溶性蛋白含量的下降速度大于無斑點(diǎn)植株（CK）（圖5b）。突變體Spl34葉片的可溶性蛋白含量在開花期開始時(shí)是18.26mg/g（鮮葉），在開花15d后下降速度變快，30d時(shí)降至5.90mg/g（鮮葉）。結(jié)果表明，突變體Spl34斑點(diǎn)的形成導(dǎo)致葉片葉色指標(biāo)迅速降低，隨著斑點(diǎn)出現(xiàn)的爆發(fā)下降速度增加。同時(shí)葉片中的可溶性蛋白也有同樣的下降趨勢；可溶性蛋白大多是參與各種代謝的酶類，因此可以推測斑點(diǎn)的形成一定程度上降低了代謝酶活性，影響了突變體Spl34的代謝活動(dòng)。

2.5 光合作用指標(biāo)的測定 光合作用指標(biāo)測量結(jié)果顯示，開花期突變體Spl34的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Ts）分別為11.54μmol/m2·s、0.23mol/m2·s、301.50mmol/m2·s、4.26μ mol/m2·s；而無斑點(diǎn)植株（CK）分別為17.70μmol/m2·s、0.26mol/m2·s、258.78mmol/m2·s、4.60μ mol/m2·s。從試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)開花期突變體Spl34的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均低于無斑點(diǎn)植株（CK），其中凈光合速率差異性極顯著，而胞間CO2濃度則極顯著高于無斑點(diǎn)植株（CK）（圖6）。表明突變體Spl34植株斑點(diǎn)的出現(xiàn)影響了水稻葉片的光合作用。2.6 H2O2和的檢測 為了進(jìn)一步了解突變體Spl34的抗活性氧（ROS）能力和抗逆性，設(shè)置了NBT、DAB的染色試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體Spl34葉片斑點(diǎn)部位經(jīng)NBT染色后仍是褐色，沒有出現(xiàn)藍(lán)-紫色沉淀（圖7a）；經(jīng)DAB染色后，斑點(diǎn)部位并沒有明顯的黑褐色沉淀（圖7b）。結(jié)果表明，突變體Spl34斑點(diǎn)部位沒有大量積累和H2O2，因此推測突變體Spl34比無斑點(diǎn)植株（CK）有更強(qiáng)的抗氧化能力。

圖5 開花期突變體Spl34與無斑點(diǎn)植株（CK）的SPAD值和可溶性蛋白含量變化

圖6 開花期無斑點(diǎn)植株（CK）與突變體Spl34劍葉的光合特性

圖7 無斑點(diǎn)植株（CK）與突變體Spl34的NBT、DAB染色反應(yīng)

3 結(jié)論與討論

在以往的報(bào)道中，大多數(shù)水稻突變體斑點(diǎn)性狀的出現(xiàn)都會(huì)影響農(nóng)藝性狀，如水稻斑點(diǎn)葉突變體spl28在分蘗期株高明顯低于野生型，表現(xiàn)出嚴(yán)重的早衰現(xiàn)象[11]；水稻突變體lbsl1與野生型相比，株高、結(jié)實(shí)率和千粒重等性狀均有降低[2]。突變體Spl34植株在成熟期沒有明顯的早衰現(xiàn)象，多個(gè)農(nóng)藝性狀也無顯著差異。稻米品質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)突變體Spl34與無斑點(diǎn)植株（CK）的整精米率差異達(dá)到極顯著水平，其他指標(biāo)沒有顯著性差異。紫外光照射試驗(yàn)表明，突變體Spl34的斑點(diǎn)可能是紫外光誘導(dǎo)某種未知色素積累導(dǎo)致，未知色素的積累可能影響葉片的光合作用。SPAD值和可溶性蛋白含量的測定結(jié)果顯示突變體Spl34的SPAD值、可溶性蛋白含量均低于無斑點(diǎn)植株（CK），且下降速度較快。田間光合作用測定結(jié)果表明氣孔導(dǎo)度降低，蒸騰作用減弱，胞間CO2濃度積累，最終導(dǎo)致葉片的光合速率降低，因此影響葉片的光合作用。NBT、DAB染色試驗(yàn)結(jié)果說明突變體Spl34斑點(diǎn)部位沒有和H2O2沉積，斑點(diǎn)葉突變體Spl34比無斑點(diǎn)植株（CK）有更強(qiáng)的抗氧化能力。

發(fā)掘和鑒定各式各樣的葉色突變體，不僅有助于葉綠素合成與降解、光合作用機(jī)理等的研究，對水稻品種改良、抗病性研究也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。突變體出現(xiàn)類病變突變的原因非常復(fù)雜，如水稻類病斑突變體spl7在高溫（＞35℃）和紫外線的誘導(dǎo)下產(chǎn)生斑點(diǎn)[12]；突變體lmm4類病斑表型受自然光照的誘導(dǎo)[13]。本研究的紫外光誘導(dǎo)試驗(yàn)表明突變體Spl34斑點(diǎn)形成的誘導(dǎo)因素是紫外光，開花期是突變體Spl34斑點(diǎn)爆發(fā)的時(shí)間段；光合作用指標(biāo)測定試驗(yàn)結(jié)果表明突變體Spl34植株斑點(diǎn)的出現(xiàn)影響葉片的光合作用。目前關(guān)于細(xì)胞死亡類水稻斑點(diǎn)葉突變體的研究報(bào)道很多，如spl11[14]、spl28[11]以及最新發(fā)現(xiàn)的spl32[15]和spl33[16]等。一類由色素積累導(dǎo)致的斑點(diǎn)葉突變體還少有報(bào)道，已經(jīng)報(bào)道的spl30突變體出現(xiàn)的紅棕色斑點(diǎn)并非是由細(xì)胞死亡引起，而是未知色素的積累[3]。本研究中突變體Spl34也是一份特殊的非細(xì)胞死亡型斑點(diǎn)葉突變體，具有較好的研究應(yīng)用價(jià)值；此外，發(fā)掘新的水稻斑點(diǎn)葉突變體對增強(qiáng)植株抗病性及對抗病反應(yīng)的認(rèn)知具有重要的意義。