宋雪松 徐永江 柳學(xué)周 史 寶 王 濱 劉永山 張雅星

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半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ克隆及組織表達特性*

宋雪松1,2徐永江1柳學(xué)周1①史 寶1王 濱1劉永山1,2張雅星1,2

(1. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

利用RT-PCR和RACE方法獲得了半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ的cDNA全長序列，并采用定量PCR技術(shù)分析了其組織表達特性。半滑舌鰨RARα cDNA序列全長為1823 bp，編碼443個氨基酸；RARγ cDNA序列全長為1959 bp，編碼489個氨基酸。同源性分析顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ同源性高達60.8%，與牙鲆()同源性高達97.0%，具有較強的進化保守性。系統(tǒng)進化分析顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ分別歸屬于單獨的分支，且與其他魚類聚合成簇。組織表達分析顯示，RARα mRNA在腎中表達量最高，而RARγ mRNA在脾中表達量最高，RARα和RARγ mRNA在其他組織中均有表達，表明半滑舌鰨2種RAR都可能參與多種生理過程調(diào)控。半滑舌鰨2種RAR mRNA在有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚和無眼側(cè)正常皮膚中的表達量依次升高，且發(fā)現(xiàn)RARα在正常有眼側(cè)皮膚的表達高于RARγ，而RARγ在無眼側(cè)正常皮膚中的表達顯著高于RARα，無眼側(cè)黑化皮膚中RARα表達高于RARγ。RAR基因在有眼側(cè)和無眼側(cè)皮膚組織中的差異表達可能和RA/RAR系統(tǒng)調(diào)節(jié)體色有關(guān)。

半滑舌鰨；視黃酸受體；基因克隆；表達模式；無眼側(cè)黑化

視黃酸(Retinoic acid, RA)是一種脂溶性小分子物質(zhì)，又稱維甲酸，是維生素A(VA)在機體內(nèi)經(jīng)過一系列水解和酶催化作用生成的最終代謝產(chǎn)物。視黃酸合成進入細胞后先與重組人胞內(nèi)維甲酸結(jié)合蛋白-1 (CRABP1)和CRΑBP2蛋白結(jié)合，轉(zhuǎn)運進入細胞核，形成核受體二聚體，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(Budhu, 2002)。RA的作用是通過定位在靶細胞核內(nèi)的特異性受體介導(dǎo)的。目前，已發(fā)現(xiàn)兩類視黃酸受體：視黃酸受體(RAR)和視黃酸X受體(RXR)，作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子(Chambon, 1996)。RAR是一類細胞核受體，屬于類固醇和甲狀腺激素受體超家族，其通過與RXR形成異源二聚體(RAR/RXR)，增加與視黃素應(yīng)答元件的親和力，由此加強本身的轉(zhuǎn)錄活性和對配體的敏感性(Kliewer, 1992; Hallenbeck, 1992)。哺乳動物RAR有3種亞型：RARα、RARβ和RARγ，配體為順式視黃酸(9-cis-RA)和反式視黃酸(ATRA)(Brand, 1988)，但魚類中目前沒有發(fā)現(xiàn)RARβ亞型的存在(Jones, 1995)。研究發(fā)現(xiàn)，RA/RAR系統(tǒng)具有抑制腫瘤生長、保護上皮組織、促進胚胎骨骼心臟功能和視覺發(fā)育功能(De Luca, 1991; Zhou, 2017; Isojima, 2014)，并且在抑制細胞凋亡(Herget,1998)和免疫調(diào)節(jié)(Erkelens, 2017)也有重要生理作用，是機體維持穩(wěn)態(tài)的重要因子。

RA及其受體RAR系統(tǒng)在魚類中的研究較少(Faehnrich, 2016; Zhang, 2013; 冷向軍, 2017)。在鲆鰈類中，RA/RAR系統(tǒng)對牙鲆()骨骼發(fā)育和眼睛位移等變態(tài)發(fā)育過程(Haga, 2002; Martinez, 2007)，對塞內(nèi)加爾鰨()(Ignacio, 2009)和大西洋庸鰈()(Lewis-McCrea, 2010)骨骼發(fā)育畸形都具有重要的生理調(diào)控作用。對牙鲆的研究表明，利用9-cis-RA或者ATRA處理變態(tài)前仔魚，可以通過RA/RAR信號通路的介導(dǎo)作用抑制魚苗眼睛完成位移。同時發(fā)現(xiàn)，牙鲆和半滑舌鰨()皮膚的RA濃度在有眼側(cè)皮膚高于無眼側(cè)皮膚，且光照可通過RA/RAR信號通路誘導(dǎo)牙鲆無眼側(cè)色素過度沉著(黑化)，表明RA/RAR信號通路在半滑舌鰨、牙鲆的體色左右不對稱發(fā)育模式中起重要調(diào)控功能(Shao, 2017)，但RA/RAR系統(tǒng)對半滑舌鰨體色調(diào)控的具體機制仍待進一步研究。

半滑舌鰨屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，為我國近海自然分布的重要經(jīng)濟魚類，自人工繁育技術(shù)取得突破以來，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到快速發(fā)展，已成為鲆鰈類三大主導(dǎo)養(yǎng)殖品種之一(鄧景耀等, 1988; 柳學(xué)周等, 2006、2014)。養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨無眼側(cè)黑化(色素沉積過多)問題日益凸顯，而無眼側(cè)發(fā)生黑化的商品魚市場價格較無眼側(cè)正常魚價格低20%以上，成為制約半滑舌鰨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益的瓶頸之一。目前，國內(nèi)外對半滑舌鰨無眼側(cè)黑化發(fā)生的相關(guān)機制鮮有報道，本實驗室前期研究了半滑舌鰨體色相關(guān)功能基因POMC、MCHR與MCH等的克隆、表達調(diào)控及其與體色的關(guān)系(史學(xué)營等, 2015、2017; 朱學(xué)武等, 2016; 徐永江等, 2017)，為認識半滑舌鰨無眼側(cè)體色調(diào)控機制積累了資料。本研究擬開展半滑舌鰨RAR結(jié)構(gòu)及其表達特性研究，以期為探究RA/RAR系統(tǒng)在養(yǎng)殖半滑舌鰨無眼側(cè)黑化調(diào)控中的作用機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及樣品處理

實驗用半滑舌鰨于2017年6~8月取自山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司。取樣實驗魚3尾(都存在一定程度無眼側(cè)黑化)，體長為(33±3) cm，體重為(237±30) g，用于RAR基因克隆與組織表達特性分析。實驗魚以MS-222 (280 mg/L)麻醉后，快速取性腺、肝臟、心臟、胃、腸、脾、腎、垂體、腦、鰓、肌肉、有眼側(cè)正常皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚和無眼側(cè)正常皮膚組織投入液氮速凍后，轉(zhuǎn)入–80℃保存，用于總RNA的提取。

1.2 總RNA提取和cDNA第1鏈合成

利用RNAiso Plus (TaKaRa，日本)試劑盒并按照操作說明提取各組織樣品總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，NanoDrop 2000 (Thermo，美國)測定RNA濃度。取適量鰓組織總RNA，以PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)合成cDNA第1鏈。以SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國)合成5￠-RACE及3￠-RACE cDNA第1鏈，用于RAR基因RACE全長克隆。取等量各組織樣品的總RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)合成cDNA第1鏈，用于RAR mRNA組織表達特性及分析。各操作步驟均嚴格按照使用說明書進行。

1.3 總RNA提取和中間片段擴增

根據(jù)GenBank登記的XM_017034299.1、XM_ 008318896.2預(yù)測半滑舌鰨RARs序列保守區(qū)設(shè)計特異引物(表1)，以肝臟組織為模板，擴增RARα基因的核心序列，PCR反應(yīng)體系(25 μl)：0.2 μl酶、2.5 μl 10×PCR Buffer、2 μl dNTP Mixture、0.5 μl模板、1 μl RARα-F、1 μl RARα-R、17.8 μl ddH2O。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，38個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增RARγ基因的模板為脾臟，PCR反應(yīng)體系和條件同RARα；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的條帶并純化。回收PCR產(chǎn)物與pEASY-T1載體(北京全式金生物公司)連接，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細胞(全式金)，LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序；RAR的中間序列已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(RARα登錄號：MG596268；RARγ登錄號：MG596269)。

表1 半滑舌鰨RAR基因克隆使用的PCR擴增引物

Tab.1 Primers used for PCR amplification of RAR of C. semilaevis

1.4 RAR的RACE擴增

根據(jù)克隆驗證的中心片段設(shè)計RACE引物。用Smart RACE Advantage 2 PCR試劑盒(Clontech，美國)進行梯度PCR擴增。第1次PCR，反應(yīng)體系：17 μl ddH2O、2.5 μl Buffer、2 μl 50×dNTP Mix、0.5 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix、1 μl cDNA、引物RARα1 1 μl和1 μl UPM，共計25 μl。設(shè)計Touchdown PCR，反應(yīng)條件為94℃ 30 s，66℃30 s，72℃ 2 min，15個循環(huán)，T值每5個循環(huán)降低2℃；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，20個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。以第1次PCR產(chǎn)物稀釋10倍為模板，進行巢式PCR，反應(yīng)體系：17 μl ddH2O、2.5 μl Buffer、2 μl 50×dNTP Mix、0.5 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix、1 μl cDNA、1 μl NPM和1 μl RARα2引物，共計25 μl。PCR反應(yīng)條件同第1次PCR。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對目的條帶進行膠回收、載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆并測序。RARγ反應(yīng)體系與條件同RARα。

1.5 RAR mRNA定量表達分析

根據(jù)獲得的半滑舌鰨RARα和RARγ的cDNA序列設(shè)計定量PCR引物qRARα和qRARγ(表1)，以18S為內(nèi)參。利用Mastercycler ep realplexreal-time PCR儀(Eppendorf，德國)，使用SYBR Premix ExTMⅡ試劑盒(TaKaRa)進行定量擴增，PCR體系(20 μl)：1 μl cDNA模板、上下游引物各0.8μl (10 μmol/L)、10μl SYBR Premix ExTMⅡ和7.4 μl dd H2O.。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，58℃20 s、共40個循環(huán)。每個樣品測試設(shè)置3個重復(fù)。RAR mRNA的表達量以18S mRNA表達量為基礎(chǔ)，利用2-DD方法計算獲得(Livak, 2001)。

1.6 序列分析及數(shù)據(jù)處理

半滑舌鰨RAR基因的結(jié)構(gòu)、分子量預(yù)測、等電點預(yù)測使用ExPASy在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(www.expasy. org/tools/protparam.html)；氨基酸序列推導(dǎo)、序列拼接和氨基酸同源性分析均使用軟件DNAMAN 6.0，信號肽預(yù)測使用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)。亞細胞定位使用PSORT Ⅱ軟件(https://psort.hgc.jp/form2.html)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)，氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化分析使用ClustalW在線軟件(http://www.genome.jp/tools-bin/ clustalw)和MEGA 7軟件。通過SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，通過SWISS-MODEL在線軟件(http://www.swi-ssmodel.expasy.org/)分析預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(Mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)、Duncan和SNK多重比較分析，當<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 RAR cDNA序列結(jié)構(gòu)

半滑舌鰨RARα cDNA序列全長為1823 bp (圖1)，包括17 bp的5￠非編碼區(qū)(UTR)、1332 bp的開放閱讀框(ORF)和474 bp的3￠非編碼區(qū)(UTR)，編碼443個氨基酸，預(yù)測編碼蛋白分子量為49 kb，等電點為8.47。半滑舌鰨RARγ cDNA序列全長為1959 bp (圖2)，包括305 bp的5￠(UTR)、1497 bp的ORF和98 bp的3￠(UTR)，編碼498個氨基酸，預(yù)測編碼蛋白的分子量為55.8 kb，等電點為4.99。預(yù)測2種RAR基因的亞細胞定位均位于細胞核。

2.2 RAR編碼蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA軟件分析RAR編碼蛋白的空間二級結(jié)構(gòu)：在RARα成熟蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占34.31%，β-轉(zhuǎn)角占8.35%，無規(guī)則卷曲占43.12%，延伸鏈占14.22%。在RARγ成熟蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占36.75%，β-轉(zhuǎn)角占9.44%，無規(guī)則卷曲占40.36%，延伸鏈占13.45%。通過SWISS-MODEL網(wǎng)站同源建模方法構(gòu)建了半滑舌鰨RAR編碼的蛋白質(zhì)可能的三級結(jié)構(gòu)，以同源建模的方法與各自的50個RA核受體家族模板構(gòu)建預(yù)測可能的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，RARα獲得6種三級結(jié)構(gòu)模型，選取GMQE評價值0.55、QMEAN穩(wěn)定系數(shù)-2.79(負值越大越穩(wěn)定)構(gòu)建模型；RARγ有5種，選取GMQE評價值0.61，QMEAN穩(wěn)定系數(shù)-2.13構(gòu)建模型。三級結(jié)構(gòu)模型顯示(圖3)，RAR蛋白質(zhì)分為3部分，藍色的DBD區(qū)和LBD區(qū)通過橘黃色的D區(qū)鉸鏈區(qū)相連。

2.3 RAR的氨基酸序列同源性比較

同源性分析顯示，半滑舌鰨RARα的氨基酸序列與同屬鰈形目的牙鲆的同源性最高，為97.0%，其次為銀大麻哈魚()92.2%、鱸魚() 87.9%、斑馬魚()86.8%、紅鰭東方鲀()64.6%，且與兩棲類、爬行類、嚙齒類、鳥類和人()的相似度分別為79.6%、82.2%、80.5%、81.5%和80.7%。半滑舌鰨RARγ的氨基酸序列同樣與牙鲆同源性最高，達97%，與其他魚類的同源性均達90.5%以上，與兩棲類、嚙齒類和人的相似度分別為71.4%、84.5%和80.7%。另外，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸序列相似度為60.8% (表2)。

通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨與鱸魚、人、斑馬魚具有相似的功能結(jié)構(gòu)域，都具有DNA結(jié)合區(qū)(DBD區(qū))和配體結(jié)合區(qū)(LBD)區(qū)。利用ClustalW對半滑舌鰨RAR的氨基酸序列與其他物種的RAR氨基酸序列進行了比較(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨與其他魚類RAR的氨基酸序列整體保守性較強，除在N端的A/B區(qū)和C端的F區(qū)末尾保守型較差外，中間的DNA與配體結(jié)合區(qū)保守度較高。

2.4 RARs系統(tǒng)進化分析

利用NJ法構(gòu)建了基于氨基酸序列的半滑舌鰨RARα、RARγ和其他脊椎動物的系統(tǒng)進化樹(圖5)，半滑舌鰨RARα和RARγ都分別與鰈形目、鱸形目、鯉形目等其他魚類形成獨立的分支，而兩棲類、哺乳類和爬行類形成獨立的分支。

2.5 RARmRNA的組織表達特性

半滑舌鰨2種RAR基因在所有檢測組織中都有表達。RARα mRNA在腎臟和眼中表達量最高，與除胃的其他組織差異顯著，在胃中的表達也較高，在腦、脾臟、鰓、無眼側(cè)白皮膚、性腺、有眼側(cè)肌肉、腸、心臟、無眼側(cè)黑化皮膚、無眼側(cè)肌肉、有眼側(cè)皮膚等其他組織中也檢測到一定的表達量。半滑舌鰨RARγmRNA在脾臟和鰓中表達量最高，在心臟和腎臟表達量也較高，與其他組織差異顯著；而在無眼側(cè)白皮膚、腦、眼、胃、性腺、無眼側(cè)黑化皮膚、無眼側(cè)肌肉、垂體等其他組織表達量相對較低。在腎臟中，2種RAR mRNA表達水平都很高。脾臟、心臟、鰓、腎臟、無眼側(cè)白皮膚等組織中RARγmRNA表達量高于RARα，而在眼、胃、腸、性腺、肌肉、肝臟、有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚等組織中，RARα mRNA表達量高于RARγ，脾臟、心臟、鰓和腎臟組織中RARγ與RARα表達差異顯著，而其他組織中RARγ與RARα表達差異不顯著。腦中2種RAR mRNA表達量基本一致，表明這2種RAR基因在不同組織中的生理功能可能存在差異，即使在同一組織中其生理功能也多存在一定的差異(圖6)。

圖1 半滑舌鰨RARα基因cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

推導(dǎo)的氨基酸序列用單字母表示，從陰影顯示的起始甲硫氨酸開始計數(shù)。終止密碼子用*表示。下同

The deduced amino acid residues were represented as single letter abbreviations and numbered from the initiating methionine which was shadowed. Termination codon was marked with *. The same as below

圖2 半滑舌鰨RARγ基因cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 SWISS-MODEL預(yù)測的半滑舌鰨RARα(左)和RARγ(右)蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)

分析有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)黑化皮膚和無眼側(cè)白皮膚中2種RAR基因mRNA的表達情況(圖7)，發(fā)現(xiàn)無眼側(cè)白皮膚的2種RAR mRNA的表達量最高，其次為無眼側(cè)黑化皮膚，最低的為有眼側(cè)皮膚，其中，RARγ表達差異顯著。RARγ在無眼側(cè)未黑化皮膚中的表達顯著高于RARα (<0.05)，而在正常有眼側(cè)皮膚和無眼側(cè)黑化皮膚中，RARα的表達高于RARγ，表明可能RARα和RARγ對皮膚組織中色素的調(diào)控作用具有不同的調(diào)控機制。

3 討論

本研究獲得了半滑舌鰨RAR的2個亞型RARα和RARγcDNA序列全長，并研究了其組織表達特性，為研究RA/RAR系統(tǒng)對體色異常調(diào)控提供了基礎(chǔ)材料。本研究獲得了半滑舌鰨2個RAR亞型的結(jié)構(gòu)，預(yù)測未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽(Napoli, 1996)。同其他脊椎動物一致，半滑舌鰨RAR具備A~F共6個功能域，在進化過程中高度保守，其中，C區(qū)最為保守，具有鋅指結(jié)構(gòu)功能的為DBD區(qū)。E區(qū)在配體結(jié)合中起輔助作用，形成疏水氨基酸殘基。D區(qū)作為鉸鏈連接DBD和LBD (Leid, 1992)。同源性分析表明，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸序列與牙鲆的同源性最高，達97%，與其他魚類、兩棲類、爬行類、嚙齒類和人的氨基酸同源性也處于較高水平，表明其在進化過程中保守性較強。同時，本研究顯示，半滑舌鰨RARα和RARγ的氨基酸同源性達60.8%，但在進化樹上屬于2個不同的進化分支，表明在進化過程中2種RAR受體基因出現(xiàn)了進化差異。

表2 半滑舌鰨RAR氨基酸序列與其他脊椎動物的同源性比較

Tab.2 Comparison of homology of the precursor peptide sequences of RAR gene between C. semilaevis and other vertebrates

圖4 半滑舌鰨與其他物種的RAR氨基酸序列比較

“*”表示一致的氨基酸；“:”表示高度保守度的氨基酸；“.”表示低保守度的氨基酸；陰影部分表示DBD和 LBD功能結(jié)構(gòu)域；RAR氨基酸序列號見表2；CS：半滑舌鰨；DR：斑馬魚LJ：鱸魚；HS：人

Asterisks (*) indicated identical amino acid sequences; Dot (:) indicated highly conserved amino acid sequences; Dot (.) indicatedamino acid sequences of low degree conserved; GenBank accession numbers were shown in Tab.2. The shadow part represents the DBD and LBD functional domains CS:;DR:; LJ:;HS:

圖5 基于RAR氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹

圖6 半滑舌鰨RAR mRNA在不同組織中的相對表達量

BR：腦；EYE：眼；GI：鰓；H：心臟；L：肝臟；SP：脾臟；K：腎臟；ST：胃；I：腸；GO：性腺；EM：有眼側(cè)肌肉；BM：無眼側(cè)肌肉；ES：有眼側(cè)皮膚；BHS：無眼側(cè)黑化皮膚；BWS：無眼側(cè)白皮膚；P：垂體。不同組織表達差異分析中Y和y字母代表單獨分析RARγ的2個顯著差異集合，RARα單獨分析使用a、b、c，代表3個顯著差異集合，同一組織2種基因表達顯著差異(<0.05)用大括號表示，下同

B: Brain; EYE: Eye; GI: Gill; H: Heart; L: Liver; SP: Spleen; K: Kindey; ST: Stomach; I: Intestine; GO: Gonad; EM: Eye-side muscle; BM: Blind-side muscle; ES: Eye-side skin; BHS: Blind-side hypermelanosis skin; BWS: Blind-side white skin; P: Pituitary. In different tissue expression analysis, Y and y letters represent two distinct different sets of RARγ analysis separately, RARα analysis alone, a, b and c represent three significant different sets. The significant difference in the expression of two genes in the same tissue is expressed in braces (<0.05), the same as below

圖7 半滑舌鰨RAR mRNA在皮膚組織中的相對表達量

ES：有眼側(cè)皮膚；BHS：無眼側(cè)黑化皮膚；BWS：無眼側(cè)白皮膚

ES: Eye-side skin; BHS: Blind-side hypermelanosis skin; BWS: Blind-side white skin

本研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨2種RAR基因mRNA在所有檢測組織中均有表達，表明其均具有廣泛的生理作用。RARα mRNA在腎臟中表達量最高，表明腎臟可能為其主要靶器官，而同時在眼、腦和胃中的表達量高于其他組織，表明RARα在這些組織器官的生理功能中都可能起重要的調(diào)控作用，這種組織表達分布特征與斑馬魚(Joore, 1994)、鱸魚(錢云霞等, 2012)以及哺乳動物(Meng, 2011) RARα的組織表達特性相似。另外，半滑舌鰨RARγmRNA的主要靶器官為脾臟和鰓，同時，在心臟和腎臟中均有高表達量，表明RARγ主要在這些器官中起重要的表達調(diào)控作用。2種RAR受體mRNA都在腎臟中具有高表達，推測腎臟可能是RA/RAR信號通路的重要作用靶點，具體作用方式有待于下一步深入研究。對虹鱒()的研究結(jié)果表明，鰓是RAR的主要表達器官，推測與其較高的新陳代謝速率有關(guān)，也可能與RAR調(diào)節(jié)細胞生長與凋亡功能相關(guān)(Alsop, 2001)。本研究也發(fā)現(xiàn)，鰓中2種RAR受體基因的表達量較高，但其具體的生理功能有待于進一步研究。在對雞()的RARγ研究中，發(fā)現(xiàn)雞與哺乳動物有相似的表達特異性，即RARγ表達高度限制在皮膚中(Michaille, 1994)，然而，半滑舌鰨RAR表達在皮膚和肌肉相對其他組織較少，這種組織分布的差異主要可能是由種的差異引起的。

本研究中，比較了有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)白皮膚和無眼側(cè)黑化皮膚中2種RAR基因mRNA的表達情況和兩者的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在正常有眼側(cè)皮膚中和在無眼側(cè)黑化皮膚中RARα的表達略高于RARγ，而在無眼側(cè)未發(fā)生黑化的皮膚中，RARγ的表達卻顯著高于RARα。先前對半滑舌鰨色素細胞的研究表明，黑色素與虹彩細胞等的數(shù)量分布以有眼側(cè)皮膚中最多，無眼側(cè)黑化皮膚中其次，而無眼側(cè)白皮膚中無黑色素細胞分布(史學(xué)營等, 2015)。這種不同狀態(tài)的皮膚組織中RAR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達與黑色素細胞分布的關(guān)系表明，RARγ與RARα均參與了半滑舌鰨皮膚組織中黑色素細胞的生長發(fā)育與分布調(diào)控過程，但其在皮膚組織中黑色素細胞的形成方面具有差異表達調(diào)控作用。與RARγ相比，RARα與皮膚中黑色素細胞的生長及數(shù)量分布調(diào)控可能具有更為密切的關(guān)系。今后應(yīng)結(jié)合鲆鰈類黑色素相關(guān)基因(如MCH、MCHR、POMC等)的表達和作用機理進行深入研究，探討它們之間的相互作用關(guān)系。

在牙鲆研究中，RARs與配體ATRA結(jié)合作用于苗種骨骼變態(tài)和體色沉著(Haga, 2003)。Shao等(2017)通過轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，牙鲆和半滑舌鰨有眼側(cè)皮膚ATRA和9-cis-RA濃度均高于無眼側(cè)皮膚，但兩側(cè)皮膚中RAR和RXR的基因表達沒有明顯差異。本研究未能測定不同類型皮膚中的RAR配體濃度，是否是配體濃度梯度的差異導(dǎo)致受體基因表達量的差異有待于今后深入研究。結(jié)合本研究RAR在皮膚中的分布，推測半滑舌鰨RAR可能與黑色素細胞的發(fā)育及分布具有不同的關(guān)系。已有研究證明，在斑馬魚中存在RARα-a和RARα-b亞型(Hale, 1993)，而半滑舌鰨基因組預(yù)測其具有RARα、RARβ和RARγ三種亞型，同時，每一種亞型又有數(shù)種不同的分子形式(Chen, 2014)，開展RAR基因在不同組織器官中的表達特征和可能的生理功能研究有助于闡明RA/RAR系統(tǒng)在無眼側(cè)黑化發(fā)生的機理。本研究中，還發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨RARα和RARγ mRNA在腎臟、脾臟、腦、眼、胃、無眼側(cè)白皮膚、性腺等組織中同時具有高表達，且在不同的組織中2種受體基因表達量不同，表明半滑舌鰨2種RAR基因在不同的組織中生理功能不同。Shao等(2017)在成年牙鲆兩側(cè)皮膚中發(fā)現(xiàn)，感光視蛋白對光照刺激有應(yīng)答反應(yīng)，在光刺激下會影響配體RA在體兩側(cè)的濃度差，作用于RA/RAR系統(tǒng)導(dǎo)致無眼側(cè)發(fā)生黑化。工廠化養(yǎng)殖環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，幼魚通過補充RAR的配體RA控制了鲆鰈類有眼側(cè)無黑色素沉著現(xiàn)象(白化)，而過量的RA補充卻會導(dǎo)致無眼側(cè)黑色素沉著過多(黑化)(Miwa, 1999)。研究發(fā)現(xiàn)，改變光照(Shao, 2017)、鋪沙(Estevez, 2001)、棲息環(huán)境顏色(Takahashi, 2004)和養(yǎng)殖密度(Bolker, 2000)等也會影響無眼側(cè)黑色素沉著，且這些外源刺激都與攝食RA或通過眼和皮膚的感光視蛋白接收刺激產(chǎn)生RA，從而調(diào)控RAR表達，并最終作用于鲆鰈類的體色沉著有一定關(guān)系。Isojima等(2014)研究表明，鲆鰈類體色發(fā)生與分布受到多種基因表達調(diào)控。深入開展RA/RAR系統(tǒng)對體色的調(diào)控作用及其信號通路的系統(tǒng)研究將有助于揭示半滑舌鰨無眼側(cè)黑化的分子調(diào)控機制。

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Molecular Cloning and Spatial Expression of Two Retinoic Acid Receptors RARalpha and RARgammafrom

SONG Xuesong1,2, XU Yongjiang1, LIU Xuezhou1①, SHI Bao1, WANG Bin1, LIU Yongshan1,2, ZHANG Yaxing1,2

(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

Two retinoic acid receptors, RARalpha and RARgamma, were cloned fromusing RT-PCR and RACE methods, and their spatial expression patterns were investigated using a quantitative PCR assay. The results showed thatfull-length cDNA sequence encoding the RARalpha gene is 1823 bp in length, its open reading frame (ORF) length is 1332 bp, encoding 443 amino acids; the RARgamma cDNA sequence is 1959 bp in length, and the length of ORF is 1497 bp, encoding 489 amino acids. Homology analysis showed thatRARalpha and RARgamma have homology identity of 60.8%, and both have 97% homology identity with the Japanese flounder. Phylogenetic analysis showed thatRARalpha and RARgamma clustered into a separate branch with other fish counterparts. Spatial expression analysis showed that the highest expression level of RARalpha mRNA occurred in the kidney, whereas the highest expression level of RARgamma mRNA was in the spleen. RARgamma was also highly expressed in the gill, kidney, and heart. Furthermore, RARalpha and RARgamma mRNA expression were detected in all examined tissues, which indicated that these two retinoic acid receptors were both involved in multiple physiological regulation processes. In addition, the differential expression of these two RAR genes were found in the blind side and ocular skins, wherein they both had highest expression levels in the normal blind side skin, followed by the blacking blind side skin and had the lowest expression levels in the ocular side skin. In ocular skin and blind-side blacking skin, the RARalpha expression levels were higher than RARgamma but without significant difference, wherein in blind-side normal skin, the RARgamma expressed significantly higher than RARalpha. This differential expression pattern indicated that they might play important physiological roles in blind-side hypermelanosis regulation of.

; Retinoic acid receptor; Gene cloning; Expression pattern; Hyperpigmentation

LIU Xuezhou, E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

宋雪松, 徐永江, 柳學(xué)周, 史寶, 王濱, 劉永山, 張雅星. 半滑舌鰨() 2種視黃酸受體RARα和RARγ克隆及組織表達特性. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2018, 39(6): 52–64

Song XS, Xu YJ, Liu XZ, Shi B, Wang B, Liu YS, Zhang YX. Molecular cloning and spatial expression of two retinoic acid receptors RARalpha and RARgammafrom. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 52–64

* 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(2017GH05; 2017GH17)、國家海水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-47)、國家自然科學(xué)基金(31502145; 31602133)、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費項目(20603022017016)共同資助 [This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (CAFS) (2017GH05; 2017GH17), China Agricultural Research System (CARS-47), National Natural Science Foundation of China (31502145; 31602133), and Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022017016)]. 宋雪松，E-mail: 746284973@qq.com

柳學(xué)周，研究員，E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

2017-12-20,

2018-01-29

10.19663/j.issn2095-9869.20171220003

TS201.4；S917.4

A

2095-9869(2018)06-0052-13

(編輯 馮小花)