周朝偉 胡續(xù)雯 雷 駱 劉曉慶 任勝杰 楊旻珉 曹高祥 陳國梁 鄧星星 李 巖 李路寬

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熱應激對銀鯽生化指標和mRNA表達的影響*

周朝偉#①胡續(xù)雯#雷 駱 劉曉慶 任勝杰 楊旻珉 曹高祥 陳國梁 鄧星星 李 巖 李路寬

(西南大學動物科學學院水產(chǎn)系 重慶 402460)

本研究旨在探討熱應激對銀鯽()生化指標及肝臟mRNA表達的影響，選取平均體重為(72.8±10.1) g的銀鯽，分別在熱應激前(25℃，對照組)、熱應激后(32℃，0 h、2 h、6 h、10 h)和恢復適溫后6 h (25℃，恢復組)的條件下，測定機體血漿乳酸(LD)、血漿葡萄糖(Glu)、肝糖原(Gly)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和肝臟mRNA表達量變化。研究表明，實驗組乳酸含量從熱應激開始至恢復期，差異始終不顯著(>0.05)；實驗組血漿葡萄糖水平在熱應激后0 h、2 h、6 h，極顯著高于對照組(<0.01)；實驗組肝糖原水平在熱應激0 h時，極顯著高于對照組(<0.01)，其余時間點差異不顯著(>0.05)；己糖激酶活力在熱應激后2 h，顯著高于對照組(>0.05)；丙酮酸激酶活力在熱應激后6 h，極顯著高于對照組(<0.01)；熱應激后2 h，肝臟中mRNA表達量達到最高(<0.01)，恢復至適溫后，表達量與應激前無差異(>0.05)。本研究為進一步探究銀鯽的高溫應激作用機制及調(diào)控機理提供參考數(shù)據(jù)，同時，也為銀鯽養(yǎng)殖和育種等生產(chǎn)實踐提供相應參考依據(jù)。

銀鯽；熱應激；生化指標；

應激是一種常見的動物生理狀態(tài)，是動物機體對外界環(huán)境或自身內(nèi)部產(chǎn)生異常刺激時做出的各種生理應答反應的總和(李紅軍等, 2006)。生活在水中的魚類，容易受到水環(huán)境變化的刺激，主要的環(huán)境因子包括水溫、溶解氧、鹽度、氨和重金屬離子等，其中，水溫是重要的因素之一。當養(yǎng)殖環(huán)境的溫度高于或低于最適生長溫度時，會引起一系列的生理或病理變化，導致血液中各項生理生化指標改變，此時，可通過測定生化指標來反映機體代謝和健康狀況(寧軍號等, 2017)。溫海深等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，急性高溫脅迫可以引起許氏平鲉()機體血清中的皮質(zhì)醇、葡萄糖和蛋白等指標變化。邵彥翔等(2017)發(fā)現(xiàn)，水溫變化會引起云龍石斑魚(♀×♂)血清總膽固醇和葡萄糖等指標變化。何福林等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，水溫變化會使虹鱒()的紅細胞、血紅蛋白和血糖等指標改變。黃正瀾懿等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，熱應激會引起齊口裂腹魚()髓過氧化物酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶等的改變。熱激蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是一類在進化上高度保守的蛋白，廣泛存在于生物體中。研究表明，應激誘導表達熱應激蛋白與生物體的適應能力有重要的相關(guān)性(劉秀榮, 2015; 生安志等, 2016)。熱休克蛋白70 (HSP70)，作為目前研究最廣泛的和最保守的一族熱休克蛋白(Basu, 2002)，能在應激情況下迅速合成，并對應激產(chǎn)生保護耐受作用(Morimoto, 1993)。近年來，魚類HSP70在各種應激條件下的表達情況受到廣泛關(guān)注。

銀鯽()，俗稱鯽瓜子或紅鯽，鯽的近緣亞種。隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)(馬波等, 2013)，是一種重要的經(jīng)濟魚類，主要分布于歐、亞大陸的溫帶水域，其經(jīng)濟性狀、適應能力都優(yōu)于鯽魚()。目前，銀鯽在我國養(yǎng)殖范圍廣，市場需求旺盛、價格穩(wěn)定、養(yǎng)殖效益明顯。在生產(chǎn)實踐中，魚類應對環(huán)境脅迫如高溫、高密度、缺氧和細菌等的能力存在種間特異性。本研究分析了持續(xù)熱應激對銀鯽血漿葡萄糖、血漿乳酸等生化指標及mRNA表達的影響，旨在為探究銀鯽高溫應激作用機制及調(diào)控機理提供參考數(shù)據(jù)，為進一步探究魚類應激研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與設計

實驗動物購自重慶市榮昌區(qū)雙河魚技中心，挑選體格健康、大小均勻的銀鯽300尾，平均體重為(72.8± 10.1) g。用4%的食鹽水浸泡10 min后，隨機平均放入6個已消毒的室內(nèi)玻璃缸(130 cm×55 cm×55 cm)內(nèi)，暫養(yǎng)馴化1個月，水溫為(25±1)℃，飼料采用通威152飼料(粗蛋白32%)，每天投喂2次(09:00和17:00)。

1.2 實驗設計及樣品采集

本研究設置(25±1)℃的常溫對照組、(32±1)℃的高溫熱應激實驗組和(25±1)℃的高溫熱應激后恢復至常溫的實驗組，每組設3個重復，每個重復50尾魚。實驗期間，于25℃隨機選取4尾魚作為空白對照，3個實驗缸采用加熱棒(加熱棒的最高溫度為32℃)，以3℃/h(經(jīng)過預實驗表明，3個加熱棒每小時能提高3℃)的升溫速度使水溫升至32℃，在溫度達32℃后(溫度保持在32℃不變)的0 h、2 h、6 h、10 h，每個缸各采集4尾魚作為不同時間點的熱應激組，3個實驗缸中剩余樣本快速使用冰袋降溫至25℃，6 h后，從每個缸中隨機取4尾作為恢復組。采樣時，將魚投入濃度為40 mg/L的丁香酚水溶液快速深度麻醉，靜脈取血，置于有肝素抗凝劑的EP管中，4℃、3000 r/min離心10 min，制備血漿，收集上清液，保存于-80℃。采血后解剖，取約100 mg肝胰臟，凍存于液氮中。

1.3 生化指標的測定方法

取-80℃保存的血漿，使用南京建成生物工程研究所試劑盒，比色法測定乳酸濃度、己糖激酶活力和丙酮酸激酶活力；葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定血漿葡萄糖濃度；蒽酮法測定肝糖原含量。

1.4 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)

1.4.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 Trizol法提取總RNA，用紫外分光光度計確定RNA濃度及OD值，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(TaKaRa, 大連)進行反轉(zhuǎn)錄。

1.4.2 引物設計與合成 銀鯽與鯽魚具有高同源性，依據(jù)GenBank公布的鯽魚(GenBank序列號為AB092839.2)和mRNA全序列(GenBank序列號為AB039726)，使用軟件Primer 5.0設計qRT-PCR引物：HSP70 F，5￠-TGATGGAGGGAAGCC-GAAAG-3￠；HSP70 R，5￠-GAAATAGGCAGGAACTG-TGAT-3￠；β-actin F，5￠-ATGCGGAAACTGGAAAGG- 3￠；β-actin R，5￠-TGAGGGCAGAGTGGTAGA-3￠。引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.4.3 qRT-PCR反應 采用SYBR Green (TaKaRa,大連)染料法，參照熒光定量說明書(Bio-Rad)進行。對PCR產(chǎn)物進行熔解曲線分析，同時，PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測引物特異性。以1個樣品的cDNA為模板，進行10倍梯度稀釋，分別取每個數(shù)量級稀釋液2 μl作為模板進行qRT-PCR。反應體系為(25 μl)：Premix Ex(2×)，12.5 μl；上下游引物各為0.5 μl；無菌水9.5 μl；cDNA模板2 μl。反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個循環(huán)。每個樣品設3個重復，以為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗中所涉及的數(shù)據(jù)均用平均值±標準差(Mean± SD)表示，采用SPSS 21.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)。在經(jīng)過方差同質(zhì)性檢驗后，使用單因方差分析(One-way ANOVA)對數(shù)據(jù)進行分析，<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 熱應激對血漿乳酸的影響

熱應激后0 h，血漿中乳酸含量升高并達最大值(圖1)，隨著時間的增加，乳酸含量在熱應激后2 h、6 h、10 h逐漸降低，10 h時，乳酸含量顯著低于熱應激后0 h (<0.05)，恢復適溫6 h后，恢復組血漿乳酸含量與對照組差異不顯著(>0.05)。

圖1 熱應激對血漿乳酸含量的影響

不同小寫字母代表差異顯著(<0.05)，不同大寫字母代表差異極顯著(<0.01)，下同

Different lowercase letters mean significant difference (<0.05), different capital letters mean highly significant difference(<0.01), the same as below

2.2 熱應激對血漿葡萄糖的影響

與對照組相比，熱應激后0 h、2 h、6 h和10 h的血漿葡萄糖含量升高(圖2)，且在0 h、2 h和6 h極顯著高于熱應激前(<0.01)，恢復至適溫6 h后，恢復組血漿葡萄糖含量與對照組差異不顯著(>0.05)。

2.3 熱應激對肝糖原的影響

熱應激后0 h，肝糖原含量極顯著高于對照組(<0.01)；熱應激后2 h和10 h低于熱應激后0 h，差異極顯著(<0.01)，但與對照組無顯著差異(>0.05)?；謴椭吝m溫6 h后，肝糖原含量低于對照組，但差異不顯著(>0.05) (圖3)。

圖2 熱應激對血漿葡萄糖含量的影響

圖3 熱應激對肝糖原含量的影響

2.4 熱應激對己糖激酶活力的影響

己糖激酶活力在熱應激后2 h達到最大值(圖4)，顯著高于應激前(<0.05)；熱應激后6 h，仍顯著高于對照組(<0.05)?；謴秃? h，恢復組己糖激酶活力與對照組差異不顯著(>0.05)。

2.5 熱應激對丙酮酸激酶活力的影響

熱應激處理后，丙酮酸激酶活力呈下降趨勢 (圖5)。熱應激后2 h，丙酮酸激酶活力低于對照組，但差異不顯著(>0.05)，而后逐漸升高，在熱應激后6 h達到最大值，極顯著高于對照組(<0.01)；恢復適溫6 h時，恢復組丙酮酸激酶活力低于對照組，且差異極顯著(<0.01)。

圖4 熱應激對己糖激酶活力的影響

圖5 熱應激對丙酮酸激酶活力的影響

2.6 熱應激對肝臟中HSP70 mRNA表達量的影響

銀鯽遭受熱應激時，肝臟中mRNA表達量升高(圖6)，熱應激2 h后表達量達到最高，為對照組的1.96倍，差異極顯著(0.01)，熱應激6 h后仍極顯著高于對照組(0.01)；恢復適溫6 h后，恢復組mRNA表達量略高于對照組，但差異不顯著(0.05)。

圖6 熱應激對銀鯽HSP70 mRNA表達的影響

3 討論

3.1 熱應激對銀鯽血漿生理指標的影響

乳酸是機體無氧代謝的產(chǎn)物(鄒思湘, 2012)，本研究中，熱應激后，銀鯽的血漿乳酸含量先升高，后逐漸降低，說明機體在熱應激后首先會進行無氧運動，然后機體進行自身代謝調(diào)整，減緩無氧運動， 劉鳳華等(2002)對仔雞()的研究結(jié)果也支持這一論點。另外，熱應激初期，銀鯽運動較為劇烈，隨后逐漸平靜，此時，乳酸濃度也隨運動劇烈程度先升高后降低，說明魚類血漿乳酸的濃度與其應激后的活動強度有關(guān)(Fanouraki, 2011)，這與Vijayan (1992)和Vijayan等(1997)對應激條件下莫桑比克羅非魚()和虹鱒的研究結(jié)果一致。應激反應是一種耗能過程，會導致血漿葡萄糖水平的變化，因此，葡萄糖水平常被作為可靠的生理應激指標之一(Silbergeld, 1974; Sun, 1992)。熱應激處理后，乳酸含量升高時，糖原降低；接著乳酸含量降低，血漿葡萄糖含量增加；隨后肝糖原降低，葡萄糖繼續(xù)升高，說明魚類機體代謝水平易受外界溫度的影響，隨著溫度的升高，銀鯽體內(nèi)物質(zhì)代謝逐漸加快，導致糖的利用率加快，糖原等轉(zhuǎn)化成葡萄糖的速率也加快，從而使得血漿葡萄糖的濃度顯著升高，此研究結(jié)果與Hyndman等(2003)的研究結(jié)果一致。隨著熱應激時間延長，血漿葡萄糖含量逐漸降低，機體代謝雖減緩但仍在繼續(xù)，這是由于垂體-腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)能對熱應激生理過程起到一定的調(diào)節(jié)作用(王啟軍等, 2006)，如糖異生作用加強，維持血漿葡萄糖恒定。同時，肝糖原表達量在熱應激后先降低再升高，最后逐漸降低，說明肝糖原是應激過程中的重要能量物質(zhì)。熱應激后，肝糖原含量降到最低時，血漿中葡萄糖卻顯著升高，說明糖原是魚體內(nèi)糖的主要儲存形式，是魚類應激反應的重要能量來源，應激后，魚體可通過分解肝糖原來提供血糖，Wendelaar Bonga (1997)對熱應激后魚類機體的研究也與上述結(jié)論相符。

己糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解反應過程中的關(guān)鍵酶，其活性的變化對機體血糖水平具有重要影響，己糖激酶和細胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白功能相互偶聯(lián)，影響機體細胞內(nèi)葡萄糖流量和代謝(Allert, 1991)。丙酮酸激酶可通過調(diào)節(jié)細胞中ATP、ADP和糖酵解的中間產(chǎn)物，來控制糖酵解速率(鄒思湘, 2012)。機體內(nèi)主要供能的是葡萄糖，并且葡萄糖的流量與己糖激酶活力緊密相關(guān)(Allert, 1991)，本研究結(jié)果顯示，熱應激后0~2 h，己糖激酶活力與葡萄糖含量都顯著增加(<0.05)，變化趨勢幾乎一致，說明熱應激后，機體通過己糖激酶的刺激提高血糖的流量來滿足機體的需要，機體葡萄糖的大量消耗，通過糖異生作用來補充。本研究中，熱應激后2 h，銀鯽的己糖激酶活力達到最高水平，糖酵解作用加劇，糖異生作用抑制，以維持機體的血糖水平，滿足代謝的需要，說明銀鯽葡萄糖水平是通過糖酵解和糖異生這2個相對立的過程來保持的，Metón(2003)對金頭鯛()的研究也支持這一論點。

丙酮酸激酶(PK)在糖酵解過程中能夠起到關(guān)鍵作用(郭彪等, 2008)，本研究中，丙酮酸激酶活力在熱應激后先降低后升高，說明隨著應激時間的增加，耗氧率也會升高，機體供氧不足，糖酵解作用加強。熱應激6 h時，丙酮酸激酶活力顯著高于對照組，這是由于機體的代謝活動減慢，糖酵解作用降低，氧化磷酸化作用加強，致使丙酮酸激酶活力下降，這與郭彪等(2008)對對蝦的研究結(jié)果一致?；謴徒M的丙酮酸激酶活力顯著低于對照組(<0.01)，是由于糖酵解作用抑制太大，機體受影響較大，而酶活力的恢復是一個漫長的過程，所以丙酮酸激酶活力無法迅速恢復至正常值。

3.2 熱應激對肝臟中HSP70 mRNA表達量的影響

本研究中，熱應激后mRNA表達量顯著增加，并在2 h后達到最高，應激后6 h和10 h，表達逐漸降低，恢復后表達量與對照組無差異，此變化趨勢與此前報道的其他水生生物研究結(jié)果一致，如：鯽魚在應激后1 hmRNA表達量有所升高，4 h時達到最高值后逐漸降低，48 h降至最初值(蘇嶺等, 2010)；34℃持續(xù)24 h熱應激團頭魴()肝臟中mRNA相對表達量呈先上升后降低的趨勢(Ming，2010)；地中海貽貝()在35℃熱激1 h，16℃恢復3 h后，消化腺mRNA的含量達到最大值，隨后5~24 h內(nèi)逐漸減少(Franzellitti, 2005)；虹鱒RTG-2細胞在28℃持續(xù)應激24 h后，2種mRNA的表達量均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，應激后3 h表達量達最大值(王艷妮等, 2015)；大正三色錦鯉()32℃應激后2 h和26 h，mRNA的相對表達量與應激前相比顯著上升，應激后6~22 h，相對表達量與應激前無顯著差異(>0.05)(張崇英等, 2012)。以上結(jié)果說明，調(diào)節(jié)熱應激蛋白的表達量是機體細胞應對熱應激的反應之一(曲凌云等, 2005)，瞬時熱刺激誘導機體內(nèi)變性蛋白、異常蛋白量增加，正常狀態(tài)的蛋白平衡被打破，從而引發(fā)一些維持正常生命功能的酶活減弱甚至喪失?；蛲ㄟ^相關(guān)途徑的調(diào)節(jié)，細胞中mRNA含量升高，表達的蛋白增加。作為“分子伴侶”，HSP70結(jié)合變性蛋白折疊、裝配中的中間產(chǎn)物，促進多肽鏈向天然構(gòu)象轉(zhuǎn)變，修復應激給機體帶來的損害。應激后恢復時間增長，蛋白質(zhì)變性現(xiàn)象減少，的表達量回落。mRNA表達受熱應激調(diào)節(jié)，從而保護機體內(nèi)部功能不受損傷。另有學者指出，HSP70具有高度保守的序列和在受脅迫后能夠大量表達的特性，使其可能成為一種診斷魚類生理狀態(tài)的生物指標(祝璟琳等, 2007)。

綜上所述，熱應激會引起銀鯽強烈的應激反應，血漿中乳酸含量、葡萄糖含量、肝糖原含量、己糖激酶活力和丙酮酸激酶活力先升高后恢復，表明機體通過調(diào)節(jié)以上指標對抗熱應激。熱應激下基因的表達受熱應激調(diào)節(jié)，誘導表達的HSP70使機體具備一定的高溫耐受力，對應激起到一定的保護作用。本研究為了解銀鯽抗熱應激的調(diào)控機理提供一定的參考數(shù)據(jù)，為研究抗熱應激預防措施等提供新的思路。

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Effects of Heat Stress on Biochemical Indices andmRNA Expression in Gibel Carp ()

ZHOU Chaowei#①, HU Xuwen#, LEI Luo, LIU Xiaoqing, REN Shengjie, YANG Minmin, CAO Gaoxiang, CHEN Guoliang, DENG Xingxing, LI Yan, LI Lukuan

(Department of Fisheries, College of Animal Sciences, Southwest University, Chongqing 402460)

The aim of the present study was to assess the effects of heat stress and recovery on biochemical indices andmRNA expression in gibel carp (). The fishes were selected as experimental animals with an average weight of (72.8±10.1) g under laboratory conditions. Samples used to determine lactic acid (LD) content, glucose (Glu) content, glycogen (Gly) content, hexokinase (HK) activity, pyruvate kinase (PK) activity, andmRNA expression were obtained before heat stress (25℃, the control group), 0, 2, 6, and 10 h after stress (32℃), and heat stress recovery (25℃, HSR), respectively. The results revealed no significant difference in LD content compared with that in the control group (>0.05). Glu content was significantly increased at 0, 2, and 6 h (<0.01). Gly was significantly increased at 0 h (<0.01). HK activity was significantly increased at 2 h (<0.01). PK activity significantly increased at 6 h (<0.01). Meanwhile, the highestmRNA expression was observed at 2 h under heat stress (<0.01). Following HSR (25℃, 6 h), themRNA expression level recovered to the pre-stress levels (>0.05). The results provide basic data for research on the mechanism of high temperature adaption in gibel carp, as well as a scientific basis for acute temperature change in aquaculture and breeding.

; Heat stress; Biochemical indices;

ZHOU Chaowei, E-mail: zcwlzq666@163.com

10.19663/j.issn2095-9869.20171012001

Q344+.1

A

2095-9869(2018)06-0065-07

#Co-first authors

* 中央高校基本科研基金(XDJK2016C047)資助[This work was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2016C047)]

周朝偉，E-mail: zcwlzq666@163.com

2017-10-12,

2017-11-25

周朝偉, 胡續(xù)雯, 雷駱, 劉曉慶, 任勝杰, 楊旻珉, 曹高祥, 陳國梁, 鄧星星, 李巖, 李路寬. 熱應激對銀鯽生化指標和mRNA表達的影響. 漁業(yè)科學進展, 2018, 39(6): 65–71

Zhou CW, Hu XW, Lei L, Liu XQ, Ren SJ, Yang MM, Cao GX, Chen GL, Deng XX, Li Y, Li LK. Effects of heat stress on biochemical indices andmRNA expression in gibel carp (). Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 65–71

#并列第一作者：周朝偉，E-mail: zcwlzq666@163.com；胡續(xù)雯，E-mail: 2312669206@qq.com

(編輯 馬璀艷)