王金炫 王小平

江蘇省句容市糧食局中心化驗(yàn)室 江蘇句容 212400

嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，它主要有兩類：一類是赤霉致嘔毒素，能引起嘔吐；另一類是赤霉烯酮具有雌激素的作用。這些毒素主要存在于麥粒的糊粉層和皮部，故以麥麩和面筋中較多，胚乳淀粉中較小?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》GB 2761—2017規(guī)定食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）限量指標(biāo)為1000 μg/kg。國(guó)家糧食局每年進(jìn)行的夏秋兩季糧食收獲質(zhì)量、衛(wèi)生調(diào)查，就是保障我國(guó)糧食質(zhì)量衛(wèi)生安全。

句容市糧食局中心化驗(yàn)室擔(dān)負(fù)著江蘇省糧食局下達(dá)的國(guó)家糧食局夏秋兩季收獲質(zhì)量、衛(wèi)生調(diào)查和品質(zhì)測(cè)報(bào)任務(wù)，從收獲入庫(kù)到生產(chǎn)加工等環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)，把小麥中嘔吐毒素控制在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量以內(nèi)。2018年夏糧共檢測(cè)小麥樣品300余份，實(shí)驗(yàn)中掌握了GB 5009.111—2016免疫親和層析凈化高效液相色譜法嘔吐毒素測(cè)定的操作要領(lǐng)，應(yīng)用分析如下。

1 測(cè)定原理與儀器和試劑

1.1 測(cè)定原理

小麥檢測(cè)樣品中的嘔吐毒素經(jīng)水提取、免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定。樣品溶液中各組分經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過(guò)程，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式展現(xiàn)出來(lái)；再用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理，按保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量而得知被測(cè)組分含量。

1.2 測(cè)定儀器和試劑

安捷倫126液相色譜儀配有VWD熒光檢測(cè)器；感量0.01 g、0.0001 g天平；試管研磨機(jī)、離心機(jī)、超聲洗滌儀等；250 μL、1000 μL 移液槍；玻璃纖維濾紙、0.45 μm水相微孔濾膜、25 mL注射器、50 mL刻度離心管、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱。

甲醇-水溶液（30+70）：量取15 mL甲醇加入到35 mL水中混勻，使用前脫氣30 min；10%異丙酮：量取1 mL異丙酮定容至10 mL；標(biāo)準(zhǔn)品梯度的設(shè)置：待測(cè)物響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，相當(dāng)樣品濃度 μg/kg 0、300、600、1200、1800、2400（分別吸取濃度為 1.007 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液 0、0.075、0.150、0.300、0.450、0.600 mL，甲醇-水配至 1.5 mL）。

2 樣品制備

2.1 檢測(cè)樣品

檢測(cè)樣品為本市收獲質(zhì)量衛(wèi)生調(diào)查和夏糧入庫(kù)樣品共300余份，檢測(cè)時(shí)間5月21日開始至6月30日，檢測(cè)小麥類型均為混合小麥。

2.2 樣品預(yù)處理

2.2.1 去雜。雜質(zhì)是指小麥以外的其它物質(zhì)，包括篩下物、無(wú)機(jī)雜質(zhì)和有機(jī)雜質(zhì)。首先分取大樣1200 g，分四次篩選，每次數(shù)量約300 g，撿出篩上大型雜質(zhì)并棄除下層篩篩下物，合并上下層篩上的糧食籽粒測(cè)定容重；然后再進(jìn)行分樣，部分樣品留作水分和不完善粒測(cè)定，部分樣品按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定撿出所有雜質(zhì)后為凈小麥，留作粉碎。

2.2.2 粉碎。取不少于500 g樣品，用試管研磨機(jī)將其粉碎（細(xì)度通過(guò)20目）混合均勻后縮分至100 g，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供嘔吐毒素提取用。

2.3 檢測(cè)方法

水分測(cè)定按GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》方法進(jìn)行；容重測(cè)定按GB/T 5498—2013《糧食檢驗(yàn) 容重》方法進(jìn)行；不完善粒測(cè)定按GB/T 5494—2008《糧食檢驗(yàn) 糧食、油料的雜質(zhì)、不完善粒檢驗(yàn)》方法進(jìn)行；嘔吐毒素測(cè)定按GB 5009.111—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》中第二法《免疫親和層析凈化高效液相色譜法》進(jìn)行。

3 測(cè)定步驟與結(jié)果

3.1 試樣提取

按脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱使用說(shuō)明書操作，具體步驟如下：

稱取小麥粉碎樣品25 g（準(zhǔn)確到0.1 g）于250 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加水125 mL混勻，置振蕩器振蕩20 min。提取液倒入試管中離心10 min（6000 r/min），上清液用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，收集濾液于50 mL刻度離心管中。

樣品濾液凈化。將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，拔出堵頭流盡免疫親和柱內(nèi)原有液體，準(zhǔn)確移取樣液2.5 mL于親和柱中，連接注射器樣液以每秒1滴流速通過(guò)親和柱；樣液流盡后吸取20 mL水于注射器中以每秒2滴的流速通過(guò)免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中，抽干小柱。

樣品凈化液洗脫。注入1.5 mL甲醇于親和柱中以每秒1滴流速進(jìn)行洗脫，然后將洗脫好的樣液倒入注射器針筒，連接0.45 μm水相微孔濾膜和液相上機(jī)小瓶，洗脫液通過(guò)濾膜進(jìn)入小瓶，再以1∶1洗脫液和水進(jìn)行稀釋混勻待測(cè)。

3.2 安捷倫126液相色譜儀參考條件

色譜柱：Eclipse XDB—C18，4.6×25 mm，5 μm；流動(dòng)相：甲醇:水（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm；樣品采集時(shí)間：10 min。

表1 部分小麥樣品嘔吐毒素檢測(cè)結(jié)果

3.3 開機(jī)

3.3.1 軟件操作（雙擊軟件用首次創(chuàng)建的方法）

首先管沖洗：開啟儀器狀態(tài)準(zhǔn)備就緒后，四元泵右擊方法，扭松排液閥，改流量5.000，A管應(yīng)用（約2 min氣泡排完）；B管輸100應(yīng)用，氣泡排空后改0，C管D管依次沖洗。

然后柱沖洗：改流量 1.000，改 B 管 30（30∶70 甲醇水為流動(dòng)相）應(yīng)用，關(guān)排液閥，沖洗20 min。

樣品盤設(shè)置（P1盤和P2盤可隨意放置）：如采用P1盤可以P1a1空白；P1a2至P1a7校正標(biāo)準(zhǔn)；P1a8樣品依次排列。

3.3.2 樣品檢測(cè)

在線信號(hào)選擇VWD，去掉FLD，基線走平后點(diǎn)運(yùn)行；樣品自動(dòng)檢測(cè)。

3.3.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)選擇：方法右擊關(guān)聯(lián)全部，信號(hào)FPD（關(guān)掉ECD）；打開數(shù)據(jù)今天的所有標(biāo)樣和樣品，選用GC/CC定量，調(diào)用前處理，方法另存輸文件名保存。

看色譜圖：看被測(cè)物出峰時(shí)間刪去多余雜峰，應(yīng)用空白扣除，所有進(jìn)樣，使用指定空白確定；點(diǎn)擊色譜圖中的留用峰，峰作為化合物添加到方法；輸入有關(guān)信息，點(diǎn)重新處理全部。

查看數(shù)據(jù)處理：峰詳細(xì)信息、色譜圖、校正曲線、樣品信息、進(jìn)樣結(jié)果。

3.4 檢測(cè)結(jié)果

3.5 關(guān)機(jī)

清洗管路：點(diǎn)擊儀器狀態(tài)把A管純水瓶中管路放入甲醇瓶中，四元泵右擊方法，旋排空閥去掉B管，改流速改為5 mL，沖洗5 min；沖柱子：流量改為1，關(guān)排空閥沖洗20 min；打開另一軟件，關(guān)閉連接、確定、否，關(guān)閉圖譜、關(guān)檢測(cè)器、關(guān)主機(jī)。

4 檢測(cè)質(zhì)量控制

應(yīng)用GB 5009.111測(cè)定嘔吐毒素含量，為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠程度，對(duì)檢測(cè)工作過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行有效控制，確認(rèn)儀器的性能及整個(gè)檢測(cè)工作質(zhì)量是否滿足實(shí)驗(yàn)要求。

4.1 加標(biāo)回收試驗(yàn)

免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定嘔吐毒素法樣品前處理比較復(fù)雜，操作稍有不當(dāng)就會(huì)使樣品含量損失或污染，加標(biāo)回收是最好的驗(yàn)證方法。通過(guò)回收率找出實(shí)驗(yàn)中各環(huán)節(jié)存在的問(wèn)題，以確定其檢測(cè)方法的適用程度。加標(biāo)要從樣品提取開始，進(jìn)行空白加標(biāo)、試樣加標(biāo)、洗脫過(guò)濾后樣液三種類型加標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：空白加標(biāo)回收106.6%、試樣加標(biāo)回收102.1%、洗脫后樣液加標(biāo)回收99.97%；符合GB/T 27404—2008附錄F回收率80.0%～110.0%規(guī)定；證明免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定嘔吐毒素檢測(cè)方法適用。

4.2 人員比對(duì)

進(jìn)行人員比對(duì)同一樣品，相同儀器，不同人員進(jìn)行操作，衡量人員操作技術(shù)水平是否符合規(guī)范要求。

從表2中可以看出，應(yīng)用GB 5009.111法測(cè)定嘔吐毒素操作正確、技術(shù)過(guò)關(guān)、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，符合GB 5009.111重復(fù)條件下兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的23%規(guī)定要求。

表2 不同人員之間測(cè)定驗(yàn)證數(shù)據(jù)表

5 應(yīng)用與分析

應(yīng)用GB 5009.11法測(cè)定無(wú)機(jī)嘔吐毒素含量，一是流動(dòng)相必須脫氣處理，以提高檢測(cè)靈敏度；二是選擇合適標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度，取得標(biāo)準(zhǔn)品良好線性；三是選擇適合流動(dòng)相，以獲得較好峰形；四是進(jìn)行質(zhì)量控制，保證檢測(cè)工作質(zhì)量。

5.1 脫氣處理流動(dòng)相提高檢測(cè)靈敏度

流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體，以防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。

5.2 選擇合適標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度取得良好線性

實(shí)踐中不斷摸索，選用合適的標(biāo)準(zhǔn)梯度，保證樣液中待測(cè)物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，使校正曲線相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999以上，確保樣品檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)性、準(zhǔn)確性。

5.3 選擇適合流動(dòng)相以獲得較好峰形

改善峰形，是提高靈敏度和定量分析精確度的目的。實(shí)際分析過(guò)程中，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和具體情況進(jìn)行調(diào)整流動(dòng)相的配比，樣品出峰時(shí)間和峰形與流動(dòng)相極性有很大關(guān)系，峰的保留時(shí)間6至15 min為宜；色譜峰區(qū)域?qū)挾?，是反?yīng)色譜分離條件好壞的重要參數(shù)，使其達(dá)到峰高的0.607處的要求。

5.4 進(jìn)行質(zhì)量控制保證方法準(zhǔn)確應(yīng)用

加標(biāo)回收試驗(yàn)和開展技術(shù)核查是確保檢測(cè)工作質(zhì)量的具體措施，是衡量檢測(cè)人員的業(yè)務(wù)技術(shù)水平，驗(yàn)證選用的檢測(cè)方法是否得當(dāng)，了解儀器性能的掌握情況，使之能夠更好地應(yīng)用方法，掌握操作技能，確保檢測(cè)工作質(zhì)量目標(biāo)的實(shí)施。

綜上所述，免疫親和層析凈化高效液相色譜法測(cè)定嘔吐毒素，要做到實(shí)驗(yàn)環(huán)境滿足儀器運(yùn)行條件，操作人員掌握技術(shù)要領(lǐng)，采取必要的質(zhì)量控制技術(shù)以核查驗(yàn)證符合要求，才能確保準(zhǔn)確應(yīng)用。