劉學(xué)飛，張俊梅，徐龍

解放軍第202醫(yī)院1腫瘤介入科，2皮膚科，沈陽110812

3沈陽軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科，沈陽110812

乳腺癌是一種在女性人群中常見的惡性腫瘤， 嚴(yán)重威脅女性健康。在西方發(fā)達(dá)國家，乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位，其致死率僅次于肺癌[1-2]。近年來隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活節(jié)奏和生活習(xí)慣的改變，乳腺癌在中國女性人群中的發(fā)病率逐年升高[3]。目前臨床上對于乳腺癌的治療主要以手術(shù)和化療相結(jié)合為主，但乳腺癌細(xì)胞具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散能力，預(yù)后效果并不理想[4-5]。因此，從分子水平研究乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲機(jī)制，從而尋找有效的治療方法具有重要意義。Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein，RKIP）是磷脂酰乙醇胺家族成員之一，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)多組激酶信號通路中發(fā)揮重要作用[6-7]。核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）是一類轉(zhuǎn)錄因子，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，能參與多種基因的表達(dá)調(diào)控[8]。研究表明，RKIP能夠抑制腫瘤細(xì)胞中NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和凋亡，但兩者在乳腺癌細(xì)胞中的關(guān)系尚未清楚[9]。本研究分析了良性和惡性乳腺腫瘤組織中RKIP的表達(dá)水平，探討了人乳腺癌細(xì)胞中RKIP對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響及與NF-κB可能存在的關(guān)系，旨在為乳腺癌的臨床治療及預(yù)后評估提供新的靶點(diǎn)，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 標(biāo)本收集

收集2015年4月至2016年12月于解放軍第202醫(yī)院就診的63例乳腺腫瘤患者的腫瘤組織標(biāo)本。所有患者均為女性，在手術(shù)前均未接受過任何放療、化療、內(nèi)分泌治療。63例乳腺腫瘤組織中，良性乳腺腫瘤組織28例，患者年齡為18～58歲，平均（33.28±3.57）歲；惡性乳腺腫瘤組織35例，患者年齡為21～60歲，平均（36.43±3.82）歲。

1.2 細(xì)胞及載體

高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435和GV141載體均購自上海博谷生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fatal bovine serm，F(xiàn)BS）均購自美國Sigma公司，兔抗人RKIP抗體購自北京美天晴生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000購自美國Life Technology公司，SP免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Trizol和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒均購自美國Sigma公司，NF-κB引物購自上海生工生物工程有限公司，Transwell小室和Matrigel液均購自美國Corning Life Sciences公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，高壓滅菌鍋購自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司，BioTek Synergy HT酶標(biāo)儀、DYC-p32型電泳槽均購自美國Bio-Rad公司，Leica DC300F顯微照像系統(tǒng)購自日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測良性和惡性乳腺腫瘤組織中RKIP的表達(dá)水平

所有腫瘤組織標(biāo)本均由本院病理科醫(yī)師經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋后保存。分別從良性和惡性乳腺腫瘤組織中隨機(jī)選取10個標(biāo)本，每個標(biāo)本取3張切片，按照說明書中的操作步驟，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中RKIP蛋白的表達(dá)水平，每張切片隨機(jī)選取3個視野，在光學(xué)顯微鏡下觀察其染色情況，用光學(xué)顯微鏡測定觀察區(qū)域陽性細(xì)胞的積分光密度值（integrated optical density，IOD）。

2.2 MDA-MB-435細(xì)胞轉(zhuǎn)染

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)移至DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并進(jìn)行傳代，取2～3次傳代后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板中，密度為8×105/孔，保證在轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度為80%～90%。

2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備 將含有RKIP基因的cDNA插入GV141載體中構(gòu)建RKIP質(zhì)粒，作為RKIP過表達(dá)組的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；以空白GV141載體構(gòu)建空白質(zhì)粒，作為對照組的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。將 2 μg 上述配制好的質(zhì)粒和 5 μl的 Lipofectamine 2000分別加入250 μl DMEM選擇培養(yǎng)基中，充分混勻后用移液槍輕輕吹打，室溫下孵育20 min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。

將傳代的MDA-MB-435細(xì)胞轉(zhuǎn)移至不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，密度為8×105/孔，將上述配制好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中，與MDA-MB-435細(xì)胞共培養(yǎng)12 h，然后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，構(gòu)建RKIP過表達(dá)的細(xì)胞系和RKIP正常表達(dá)的細(xì)胞系。

2.3 Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移能力

2.3.1 MDA-MB-435單細(xì)胞懸液制備 將轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞離心，棄上清液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，加入含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，用移液槍將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/孔。

2.3.2 接種及培養(yǎng)細(xì)胞 將200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室中，同時向其中加入含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，下室中加入等量的不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.3.3 細(xì)胞計數(shù)Transwell小室培養(yǎng)24 h后取出，擦去上室內(nèi)細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，轉(zhuǎn)用33%醋酸溶液洗脫，在Leica DC300F顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野觀察并拍照，計算細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲能力

將50 mg/L的Matrigel液按1∶8稀釋后，包被在Transwell小室底部膜的上室面，37℃環(huán)境下風(fēng)干，使Matrigel聚合為凝膠，形成人工基底膜。后續(xù)步驟同2.3.1、2.3.2和2.3.3。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測RKIP蛋白的表達(dá)情況

將細(xì)胞用RIPA細(xì)胞裂解液裂解后提取蛋白質(zhì)，用10%分離膠溶液、5%濃縮膠溶液灌注后進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC膜），將NC膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h，先后加入稀釋后的一抗、二抗，TBST洗滌NC膜；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色；膠片掃描后應(yīng)用Bandscan 5.0軟件進(jìn)行灰度分析。RKIP蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示RKIP蛋白的表達(dá)水平。

2.6 RT-PCR檢測NF-κB基因的表達(dá)情況

應(yīng)用Trizol試劑盒提取總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取2μl RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。GAPDH正向引物為5'-GCATAATAATGAGCCAAGGACT-3'，反 向引物為 5'-AGAACGTCTCTCACTT-3'；NF-κBmRNA的正向引物為5'-GTCTTCCTGCTACACTCTTA-3'，反向引物為5'-ACACACTCCTGTGAACGCC-3'。NF-κBmRNA及GAPDH的擴(kuò)增條件：94℃ 2 min（預(yù)變性）；94 ℃ 30 s（變性），55 ℃ 30 s（退火），72 ℃ 2 min（延伸），共35個循環(huán)；72℃總延伸6 min。取5μl RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，分析目的基因NF-κBmRNA和內(nèi)參基因GAPDH條帶的灰度值，計算NF-κBmRNA的相對表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RKIP表達(dá)水平的比較

良性乳腺腫瘤組織中RKIP的表達(dá)水平較高，IOD值為（0.527±0.057），高于惡性乳腺腫瘤組織的（0.217±0.048），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.64，P=0.03）。

3.2 RKIP過表達(dá)對細(xì)胞遷移和侵襲的影響

RKIP過表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù)目和侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯少于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 RKIP過表達(dá)組和對照組MDA-MB-435細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目的比較（±s）

表1 RKIP過表達(dá)組和對照組MDA-MB-435細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目的比較（±s）

組別R KIP過表達(dá)組對照組t值P值4 9.6 7±3.3 3 1 2 3.0 0±7.0 0 1 7.3 7 0.0 0 1 3 0.6 7±2.3 3 1 0 4.3 3±1 0.6 7 1 2.6 8 0.0 0 5遷移細(xì)胞數(shù)目侵襲細(xì)胞數(shù)目

3.3 Western blot檢測RKIP蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，RKIP過表達(dá)組的RKIP表達(dá)水平為（0.059±0.005），明顯高于對照組的（0.009±0.002），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.89，P＜0.01）。

3.4 RT-PCR檢測NF-κB mRNA表達(dá)水平

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，RKIP過表達(dá)組中NF-κBmRNA的相對表達(dá)量為（0.120±0.016），明顯低于對照組的（0.380±0.025），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.767，P=0.001）。

4 討論

乳腺癌是世界范圍內(nèi)威脅女性身心健康的一種致死性惡性腫瘤，在中國女性人群中的發(fā)病率呈增長趨勢[1-2]。目前對于乳腺癌的治療主要以手術(shù)和化療為主，但這些手段只能控制原發(fā)腫瘤，一旦腫瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，會極大地影響預(yù)后，致使患者的病死率大大增加[4-5,10]。因此，研究乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的分子機(jī)制，從而找到抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散和惡化的治療途徑，提高早期診斷率，降低病死率，是目前臨床上迫切需要解決的問題。

腫瘤轉(zhuǎn)移被視為腫瘤發(fā)展至晚期的標(biāo)志[11]。研究表明，RKIP與結(jié)腸癌、乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。姚志強(qiáng)等[14]研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中RKIP的陽性表達(dá)率為51.9%，低于癌旁乳腺組織和乳腺增生癥組織的81.8%、100%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示RKIP在乳腺腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，而這種現(xiàn)象可能與乳腺癌的發(fā)展有關(guān)。本研究檢測了良性與惡性乳腺腫瘤組織中RKIP的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，良性乳腺腫瘤組織中RKIP的表達(dá)水平高于惡性乳腺腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與上述研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，RKIP過表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù)目為（49.67±3.33），明顯少于對照組的（123.00±7.00），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；RKIP過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)目為（30.67±2.33），明顯少于對照組的（104.33±10.67），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示RKIP高表達(dá)可使乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到顯著抑制，表明RKIP基因可能與乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)。

NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、遷移、侵襲等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，在卵巢上皮性腫瘤和乳腺癌組織中均發(fā)現(xiàn)了NF-κB的高表達(dá)[9,14]。研究證實(shí)，NF-κB對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用受上游RKIP的直接影響，RKIP能夠抑制NF-κB的表達(dá)及其作用的發(fā)揮[9]。本研究結(jié)果顯示，RKIP過表達(dá)組中RKIP的表達(dá)水平為（0.059±0.005），明顯高于對照組的（0.009±0.002），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。RKIP過表達(dá)組中NF-κBmRNA的相對表達(dá)量為（0.120±0.016），明顯低于對照組的（0.380±0.025），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。提示 RKIP過表達(dá)能夠抑制NF-κBmRNA的表達(dá)，RKIP對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控可能與其對NF-κB的抑制作用有關(guān)。

綜上所述，RKIP與乳腺癌的惡化程度有關(guān)，RKIP能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這種抑制作用可能是通過對NF-κB的負(fù)調(diào)控而實(shí)現(xiàn)。