蔣成，付云云，楊云潔，李晗，魏妙宏，陳安均，劉興艷，張志清

(四川農業(yè)大學 食品學院，四川 雅安，625014)

無花果(FicuscaricaLinn)稱蜜果、天仙果，屬于?？崎艑俚闹参锕麑峓1]。無花果營養(yǎng)豐富，富含多糖、黃酮、呋喃香豆素內酯等功能成分[1-2]。同時，還含有有機酸、氨基酸、礦質元素等[3]，有文獻報道無花果的氨基酸含量高達4 000 mg/kg[4]，鮮果中氨基酸種類有18種，含有人體所需的8種必需氨基酸[5]。目前，無花果主要以鮮食和藥用價值為主[3]，然而，無花果受季節(jié)影響強，極不耐貯藏，常溫一般貯藏1～2 d[1]，極大制約了無花果產業(yè)的發(fā)展。有研究提出，將無花果釀制成酒，能夠保留無花果的營養(yǎng)價值和藥用價值，延長保存時間[6]，無花果酒具有改善血脂和控制體重等功效[7]。

高級醇指碳原子數大于2的醇類總稱，由于高級醇在水中呈現油狀又俗稱雜醇油，主要是正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、苯甲醇等醇類[8-9]。適量的高級醇賦予果酒特有醇香，增強風味，但當含量過高時，會使酒體粗糙產生異、雜味、具有致醉性，還會使人產生頭暈、惡心、嘔吐等癥狀[10]。目前，無花果酒專用酵母匱乏，采用商業(yè)釀酒酵母釀制無花果酒是一個不錯的選擇，但有文獻報道商業(yè)酵母在發(fā)酵代謝過程中產生較多的高級醇[3]。同時，有文獻報道[11]高級醇的代謝途徑為氨基酸代謝和糖代謝途徑，無花果氨基酸豐富，滿足酵母在發(fā)酵過程中產生高級醇的條件。

基于上述原因，以無花果果汁和5株優(yōu)良的商業(yè)酵母發(fā)酵無花果酒為對象，對不同酵母發(fā)酵的無花果酒中氨基酸和高級醇進行分析與對比，篩選較優(yōu)的釀酒酵母，為無花果酒的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

無花果購自雅安農貿市場；無水乙醇：色譜純，購自成都市科隆化學品有限公司；乙酸正丁酯、正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、苯乙醇：色譜純，購自上海阿拉丁試劑公司；偏重亞硫酸鈉、磷酸二氫鈉、蛋白胨、酵母粉、瓊脂為國產生化試劑。

酵母KD、D254、EC1118、X16、BO213：購自煙臺帝伯仕商貿有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.0、115 ℃滅菌20 min。

無花果果汁培養(yǎng)基：無花果破碎后榨汁，加入60 mg/L的果膠酶，0.7 g/L的硅藻土40 ℃恒溫保持4.5 h，虹吸上清液得清汁，加入SO2并調整其濃度為80 mg/L，然后加入蔗糖，調整無花果清汁糖度為20 Brix，置于4 ℃冰箱備用。

1.1.3 主要儀器設備

氣浴恒溫振蕩器(ZD-85型)，金壇市科析儀器有限公司；生物安全柜(HR40-IIA2)，南京溫諾儀器設備有限公司；生化培養(yǎng)箱(SPX-250)，上海申賢恒溫設備廠；分析天平(京制00000249號)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；電熱恒溫水浴鍋(DZKW-D-4)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；CX21雙目光源生物顯微鏡，奧林巴斯有限公司；氣相色譜儀(7890B)，Agilent Technologies；1 μL微量進樣器，上海安亭微量進樣器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化

5株活性干酵母按0.03%的比例稱取，加入質量分數為5%的糖水中，在30 ℃條件下活化30 min。將活化的酵母全部轉入無花果果汁培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min氣溫恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h，離心，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌3次，重新懸浮于細胞，用無菌生理鹽水將懸浮液菌數調至1×107CFU/mL備用[12-13]為種子液。

1.2.2 無花果酒的釀制工藝

工藝流程主要參考文獻[14-15]。

操作要點：將購買的鮮果挑選出爛果，然后清洗2～3次，進行打漿，添加5 g/L的維生素C進行護色[12]，加入60 mg/kg果膠酶，在40 ℃條件下酶解4 h后，進行過濾獲得無花果汁。用白砂糖調至無花果汁的糖度為20 °Brix，然后加入80 mg/kg SO2，接種1.2.1活化好的種子液，接種量為5%，在22 ℃條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵8 d后，進行倒罐處理，去除酒腳，然后在22 ℃條件下后發(fā)酵8～10 d，將原酒轉入磨砂廣口瓶中(每個廣口瓶倒?jié)M)、密封，在室溫下進行陳釀60 d，獲得無花果酒。

1.2.3 無花果酒理化指標的測定

分別測定5株菌株發(fā)酵無花果酒的酒精度、總酸、總糖、干浸出物，測定方法按照國標GB/T 15038—2006中的方法測定。

1.2.4 無花果酒中高級醇的測定

1.2.4.1 氣相色譜條件

HP-INNOWAX色譜柱(30 m×0.250 mm)；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持4 min后,以3.5 ℃/min升至170 ℃，以20 ℃/min升至200 ℃保持10 min；進樣量：1 μL；分流比50∶1；分流流量50 mL/min；空氣流量400 mL/min；H2流量30 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min。

1.2.4.2 混合標準溶液的配制

準確稱取正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、苯乙醇標準品0.640 0 g于100 mL容量瓶，稱取乙酸正丁酯0.8 g于100 mL容量瓶，用20%乙醇溶液定容配制成混合標準溶液貯備液和乙酸正丁酯貯備液，將貯備液進行梯度稀釋，配制成正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、苯乙醇含量為640.00、320.00、160.00、80.00、40.00、20.00、10.00 mg/L的混合標準液，不同梯度混合標準液中含有80.00 mg/L的乙酸正丁酯。

1.2.4.3 高級醇定性

根據1.2.4.1的色譜條件，取各高級醇和乙酸正丁酯的單標溶液1 μL過0.22 μm的無機水系濾膜進行氣相色譜分析，確定各物質的保留時間。

1.2.4.4 高級醇標準曲線的繪制與加標回收率

取配制好不同梯度的混合標準溶液1 μL過0.22 μm的無機水系濾膜進行氣相色譜分析，以各物質峰面積與乙酸正丁酯峰面積比值為縱坐標，高級醇標準品質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，加標回收率參考文獻[16-17]。

1.2.4.5 樣品的分析

將待測樣品過0.22 μm無機水系濾膜并加入乙酸正丁酯，使乙酸正丁酯質量濃度為80 mg/L，取1 μL進行氣相色譜分析，根據高級醇與乙酸丁酯的峰面積比值計算高級醇的含量。

1.2.5 氨基酸的測定

無花果汁及酒中氨基酸的測定，委托山東青島科創(chuàng)質量檢測有限公司進行檢測。

1.2.6 實驗數理統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件，對本實驗測得的定量數據進行統(tǒng)計分析；采用OriginLab OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發(fā)酵無花果酒的理化指標分析

對陳釀60 d無花果酒進行理化指標測定，結果見表1。

表1 5株酵母釀造無花果酒的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of fig wine fermented by5 yeast strains

注：同一列數字右上角小寫字母表示在p<0.05水平差異顯著，不同字母表示不同處理之間差異顯著，具有相同字母表示不同處理之間差異不顯著。

由表1可以看出，5株菌株發(fā)酵的無花果酒酒精度均大于11.00%vol，其中菌株X16發(fā)酵的無花果酒酒精度為11.53%vol，顯著高于其他菌株(p<0.05)。所有菌株發(fā)酵的無花果酒干浸出物含量均大于53.00 g/L，菌株BO213發(fā)酵的酒中干浸出物的含量(57.41 g/L)顯著高于其他菌株(p<0.05)。5株菌株發(fā)酵的無花果酒中殘?zhí)呛枯^低均小于6.80 g/L，說明各菌株在本實驗條件下發(fā)酵徹底。各菌株發(fā)酵無花果酒總酸含量均存在顯著差異(p<0.05)，所有酒的總酸含量均小于4.10 g/L，菌株D254發(fā)酵的酒總酸含量顯著低于其他菌株，含量為3.52 g/L。

2.2 無花果酒中高級醇的測定

2.2.1 色譜條件下不同高級醇的分離

按照1.2.4.1的色譜條件，無花果酒中的高級醇能夠得到較好的分離，各高級醇的色譜峰與標準品出峰時間一致，并且樣品中各高級醇的峰未見干擾。結果見圖1、圖2。

圖1 高級醇混合標品色譜圖Fig.1 The gas chromatogram of calibration higher alcoholsmixtur

圖2 菌株KD發(fā)酵的無花果酒中高級醇色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of calibration higher alcohols of the fig wine fermented by bacterial strain KD

2.2.2 高級醇標品線性關系、回收率測定

按照1.2.4.1的色譜條件，不同濃度的高級醇標準品的質量濃度與峰面積和具有良好的線性關系，加標回收率均高于90.00%，結果見表2。

表2 高級醇標準曲線Table 2 Standard curve of higher alcohols

2.2.3 無花果酒中高級醇含量

不同無花果酒中高級醇含量檢測見表3。由表3可知，本實驗選用5株酵母發(fā)酵的酒中主要高級醇含量為異戊醇，不同酵母發(fā)酵的無花果酒，高級醇含量存在差異，但高級醇的總量均小于350.00 mg/L，菌株EC1118與KD、D254與X16發(fā)酵的酒中高級醇含量存在顯著差異(p<0.05)，菌株BO213發(fā)酵的酒中高級醇存在含量顯著低于其他菌株，為246.60 mg/L(p<0.05)。游玲等[8]報道，正丙醇、正丁醇及正戊醇是由不同酵母代謝產生的，在本實驗條件下5株菌株發(fā)酵的酒中均未檢測出正丁醇和正戊醇。菌株EC1118發(fā)酵酒中正丙醇含量顯著高于其他菌株，為70.99 mg/L；而菌株BO213和X16發(fā)酵的酒中正丙醇含量顯著低于其他菌株(p<0.05)，含量分別為27.99、27.53 mg/L。菌株X16發(fā)酵的酒中異丁醇含量顯著高于其他菌株(p<0.05)，為64.84 mg/L。所有菌株發(fā)酵酒中高級醇含量均大于145.00 mg/L，5株菌株發(fā)酵的酒中苯乙醇含量均小于40.00 mg/L，菌株KD苯乙醇含量顯著高于其他菌株(p<0.05)為39.86 mg/L。

表3 不同無花果酒高級醇含量Table 3 Higher alcohol conten of Advanced alcohol content of different fig wine

注：同一行數字右上角小寫字母表示在p<0.05水平差異顯著，不同字母表示不同處理之間差異顯著，具有相同字母表示不同處理之間差異不顯著。

2.3 無花果酒中氨基酸含量的測定

5種無花果酒中氨基酸含量測定結果見表4。

表4 無花果酒中氨基酸含量測定 單位： mg/L

注：同一行數字右上角小寫字母表示在p<0.05水平差異顯著，不同字母表示不同處理之間差異顯著，具有相同字母表示不同處理之間差異不顯著。

由表4可知，本實驗條件下測定無花果中17種游離氨基酸總量為739.52 mg/L，5株菌株發(fā)酵無花果酒游離氨基酸總量均下降且存在顯著差異(p<0.05)，說明酵母菌在發(fā)酵過程中代謝消耗氨基酸，例如酵母在發(fā)酵過程中代謝氨基酸產生高級醇[18]，菌株X16發(fā)酵無花果果酒總游離氨基酸含量保留率最高與本實驗其他菌株存在顯著差異(p<0.05)，含量為465.72 mg/L，總游離氨基酸保留率(無花果果酒游離氨基酸含量/無花果果汁中游離氨基酸含量)為62.97%；菌株D254發(fā)酵酒中總游離氨基酸保留率較本實驗其他菌株最低僅為26.84%；不同酵母發(fā)酵的無花果酒必需、非必需、甜味、苦味及酸味氨基酸總含量均顯著下降(p<0.05)；鮮味氨基酸總含量在發(fā)酵后均顯著上升(p<0.05)，主要因為不同菌株發(fā)酵的無花果酒賴氨酸、谷氨酸含量較發(fā)酵前顯著上升(p<0.05)，這2種氨基酸為鮮味氨基酸[19]?？偘被岷恳来螢椋簾o花果汁>X16>BO213>EC1118>KD>D254。必需氨基酸含量依次為：無花果汁>X16>EC1118>BO213>KD>D254。

本試驗條件下測得無花果汁中主要的游離氨基酸為絲氨酸、脯氨酸、精氨酸含量分別為225.37、194.87、77.97 mg/L，這3種氨基酸占無花果汁游離氨基酸總量的67.37%；菌株D254發(fā)酵的無花果酒中主要的游離氨基酸為脯氨酸、精氨酸、胱氨酸、亮氨酸含量分別為74.92、27.99、12.54、11.63 mg/L，菌株BO213對應酒的主要氨基酸為絲氨酸、精氨酸、脯氨酸含量分別為55.18、38.75、124.99 mg/L，菌株X16發(fā)酵的酒主要氨基酸為絲氨酸、精氨酸、脯氨酸含量分別為102.00、61.44、131.37 mg/L，菌株EC1118發(fā)酵的酒中主要氨基酸為胱氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸、賴氨酸含量分別為27.12、44.44、61.33、17.89、16.01 mg/L，菌株KD發(fā)酵的酒中主要氨基酸為胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸，含量分別為14.51、13.27、23.00、129.86 mg/L。菌株D254、BO213、X16、EC1118、KD主要游離氨基酸占對應酒的總游離氨基酸分別為64.02%、65.63%、63.30%、61.62%、72.21%。

2.4 聚類分析

聚類分析已經被用于許多領域，有研究者對不同蜂蜜中的氨基酸進行聚類分析，將不同來源的蜂蜜進行了很好的分類[20-21]。本研究對測得無花果酒及汁的氨基酸含量進行聚類分析，可以將不同酵母發(fā)酵的無花果酒進行分類，聚類分析結果見圖3，由圖3可知，無花果汁和5株酵母發(fā)酵的無花果酒通過第1次聚類被聚為4類，無花果汁被聚為1類，菌株X16發(fā)酵的無花果酒被聚為1類，菌株KD和BO213發(fā)酵的酒歸為一類，EC1118與菌株D254歸為一類，第1次聚類將5株酵母發(fā)酵的酒聚為3類，可以看出不同酵母菌發(fā)酵無花果酒通過不同代謝途徑對無花果酒中氨基酸含量的影響是不同的。

圖3 無花果酒及汁的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis of fig wine and fig juice

3 結論與討論

通過研究5株商業(yè)酵母發(fā)酵無花果酒，對不同酵母發(fā)酵的無花果酒的高級醇、氨基酸進行了比較，篩選出最優(yōu)釀酒酵母，實驗結果表明：在本實驗條件下5株菌發(fā)酵的酒中高級醇總量均小于350.00 mg/L，魏云平[16]以高級醇指標篩選出了釀制獼猴桃酒的野生酵母SYS2000，高級醇總量為(丙醇+異丁醇+異戊醇)268.8 mg/L，本研究中丙醇+異丁醇+異戊醇含量依次為EC1118(298.77 mg/L)>X16(285.72 mg/L)>KD(276.53 mg/L)>D254(269.00 mg/L)>BO213(219.42 mg/L)，差異不大。各酒樣中高級醇總含量依次為：EC1118>KD>X16>D254>BO213。有研究表明，高級醇對葡萄酒香氣有重要的影響，適量(總量<300.00 mg/L)的高級醇可增加葡萄酒香氣的復雜性，含量過高(總量>400.00 mg/L)則會使酒的香氣粗糙[22-24]，本試驗所有樣品高級醇總量在246.60～326.01 mg/L，低于400.00 mg/L。因此，對高級醇總量進行分析，菌株X16、D254、BO213均能用于無花果酒生產。

該試驗條件下采用5株酵母將無花果汁發(fā)酵成無花果酒，游離氨基酸總量均下降，各菌株游離氨基酸總量存在顯著差異(p<0.05)，樣品中氨基酸總量依次為：無花果汁>X16>BO213>EC1118>KD>D254，菌株X16發(fā)酵的無花果酒中氨基酸總量(465.72 mg/L)顯著高于其他菌株(p<0.05)。沈穎等[25]研究荔枝酒在釀造過程中氨基酸含量的變化，發(fā)現荔枝酒中主體氨基酸較發(fā)酵前含量下降，與該研究結果相一致。氨基酸的下降，是酵母的代謝結果。高年發(fā)等[26]研究了葡萄酒釀造過程氨基酸的變化，發(fā)現葡萄酒較發(fā)酵前天冬氨酸、纈氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、精氨酸和蘇氨酸含量降低。本試驗檢測到蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸含量與發(fā)酵前相比顯著下降(p<0.05)，與前人研究結果一致。

無花果酒中含有豐富的氨基酸，為酵母發(fā)酵的過程中提供了豐富的氮源，也提供了酵母產生高級醇的前體物質，王亞欽等[24]報道一些氨基酸可參與高級醇的代謝。張光亞等[27]報道正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯甲醇的前體物質分別為蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。張文葉等[28]研究發(fā)現甘氨酸是異戊醇的前體物質。然而，本試驗條件下發(fā)酵的無花果酒中高級醇的含量并不是很高，均小于350.00 mg/L，有趣的是菌株BO213高級醇含量最低，但氨基酸含量不是最高，X16氨基酸含量最高，但高級醇不是最低，說明在本實驗條件下氨基酸與高級醇的形成相關性不高。曾朝珍等[29]報道高級醇的形成主要由氨基酸降解代謝路徑(ehrlich代謝機制)和糖合成代謝路徑(harris代謝機制)。魏云平[16]以篩選的野生酵母SYS2000為對象，研究還原糖和氨基酸對高級醇的影響，發(fā)現高級醇與還原糖的代謝遠高于相應氨基酸系數。因此，推測本試驗條件下酵母發(fā)酵無花果酒中高級醇與糖合成代謝路徑有較高的相關性。聚類分析將X16單獨聚為一類，說明X16發(fā)酵的無花果酒中氨基酸含量明顯區(qū)別于其他菌株。通過對無花果酒中氨基酸、高級醇的聚類分析，可得出菌株X16較本試驗其他菌株更適合無花果酒的生產。

本實驗建立了測定無花果酒中高級醇含量的準確方法，無花果酒中高級醇得到良好的分離，對5株釀酒酵母發(fā)酵無花果酒的高級醇及氨基酸進行了比較，篩選出較優(yōu)的酵母，為工業(yè)無花果酒的生產提供了理論基礎。