龍 瑩, 嚴俊杰, 仝宗軍, 劉媛媛, 苗 娟, 陶永新, 江玉姬, 謝寶貴

(1.福建農林大學生命科學學院菌物研究中心；2.福建農林大學園藝學院；3.福建農林大學食品科學學院， 福建 福州 350002)

真菌細胞壁的成分主要是多糖(β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖、幾丁質和甘露糖)和糖蛋白[1,2].β-葡聚糖是構成真菌細胞壁的主要多糖，位于細胞壁的內側，占細胞干重的40%～50%，主要是以β-1,3-糖苷鍵為主鏈，β-1,6-糖苷鍵為支鏈的多糖分子，其特殊的結構有助于激活機體的免疫系統(tǒng)[3,4,5].Wessels[6]曾提到真菌細胞壁的擴張包括多糖的合成與水解.β-1,6-葡聚糖合酶(β-1, 6-Glucan Synthase)是合成β-1,6-葡聚糖的關鍵基因，可能在細胞壁擴張過程中發(fā)揮著重要作用.Kottom et al[7]研究表明，β-1,6-葡聚糖合酶抑制劑能使卡氏肺孢子蟲(Pneumocystiscarinii)中β-1,6-葡聚糖的產量降低；促進卡氏肺孢子蟲編碼β-1,6-葡聚糖合酶基因Pckre6 在kre6缺陷型釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表達，恢復了釀酒酵母細胞壁的完整性，推測β-1,6-葡聚糖合酶通過參與β-1,6-葡聚糖的合成，影響細胞壁合成.

金針菇(Flammulinavelutipes)味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有降血脂、降膽固醇、抗癌等功能，具有較高的食用價值和藥用價值，在國際市場上被譽為“超級保健食品”[8,9].金針菇菌柄是主要食用部分，研究金針菇菌柄伸長生長機制有助于在生產過程中更好地控制生產條件，提高金針菇產量，帶來更多的經濟價值.Wong et al[10]研究表明，金針菇菌柄伸長時，伴隨著細胞伸長，菌柄細胞數(shù)量較原基增多，且在快速伸長階段細胞數(shù)量至少增加了40%.Kamada et al[11,12]研究表明，在長根鬼傘(Coprinusmacrorhizus)菌柄細胞伸長過程中，細胞壁組分的變化與菌柄伸長是平行的，其中多糖組分也會相應地變化.Kamada et al[13]在研究灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)菌柄伸長時發(fā)現(xiàn)由β-(1→3)和β-(1→6)兩種鍵型構成的葡聚糖組分Ⅲ的分子量顯著增加.傘菌菌柄伸長過程與涉及到細胞壁多糖的合成及降解的酶類有關，如β-葡聚糖酶類、幾丁質酶、幾丁質合酶等[14].酶與食用菌子實體形態(tài)發(fā)育密切相關，多糖組分變化過程中涉及酶類的作用機制研究尚未成熟[15].金針菇菌柄細長且伸長速度快的特征是研究傘菌菌柄細胞壁合成、細胞伸長的較好材料.

本研究根據(jù)金針菇基因組及轉錄組數(shù)據(jù)獲得到與金針菇菌柄伸長相關的β-1,6-葡聚糖合酶編碼基因fv-gs6的序列信息，并對其進行生物信息學分析，初步探究了其在金針菇子實體不同組織及生長發(fā)育階段的表達量，發(fā)現(xiàn)fv-gs6在菌柄上高表達，且在伸長期菌柄表達量最高，以期為進一步研究酶類對細胞壁合成、細胞伸長的作用機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

金針菇單核菌株Fv01-10以及雙核菌株Fv01均由福建省食用菌種質資源保藏與管理中心提供.Fv01是由Fv01-10和Fv01-N配對獲得的雙核菌株.

1.2 基因組及轉錄組數(shù)據(jù)

金針菇單核菌株Fv01-10基因組、金針菇雙核菌株Fv01不同生長發(fā)育時期轉錄組數(shù)據(jù)由福建農林大學菌物研究中心提供.

1.3 樣品處理及采集

分別采集Fv01子實體原基期、伸長期菌柄、伸長期菌蓋、成熟期菌柄及成熟期菌蓋，每個樣品收集5個生物學重復.選擇處于伸長期的菌柄(柄長約為12 cm)，采集菌蓋下方0.6～1.5 cm伸長區(qū)間及6～7 cm區(qū)間的不伸長區(qū)段樣品，每個樣品5個生物學重復.將收集的樣品置于錫箔紙中做好標記后迅速放入液氮中保存?zhèn)溆?

1.4 fv-gs6基因準確性驗證及結構分析

根據(jù)金針菇Fv01-10基因組數(shù)據(jù)得到fv-gs6基因序列，基因準確性驗證參照嚴俊杰等[16]的方法，以基因序列及上下游各500 bp為參考序列，采用Zoom lite軟件[17]將Fv01-10基因組測序所得reads庫對參考序列進行定位(相鄰paired reads距離設置為1～1 000 bp， 錯配堿基數(shù)設置為0).

在基因序列上下游各延伸2 kb作為參考序列，參照Yan et al[18]的方法，用金針菇Fv01不同生長發(fā)育時期的轉錄組數(shù)據(jù)對目的基因及其上下游序列使用Zoom lite軟件進行定位(錯配堿基數(shù)設置為40)，分析其基因結構信息.使用在線基因結構模型構建系統(tǒng)GSDS(genestructure display sever,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制fv-gs6的基因結構圖譜.

1.5 Fv-GS6蛋白生物信息學分析

蛋白結構域分析采用在線分析軟件InterProScan5 (http:// www. ebi. ac. uk/ Tools/ pfa/ iprscan5/)；Fv-GS6及其它真菌中的同源蛋白的基序(Motif)分析采用在線軟件MEME (http://meme.sdsc.edu/meme/cgibin/meme.cgi；參數(shù)設置為:number of different motifs 12; minimum number of sites 2；maximum number of sites 10; minimum motif width 10; maximum motif width 100;P<1×10-10) ；蛋白質信號肽預測與分析采用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；蛋白質跨膜結構分析采用TMHMM程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；蛋白質的亞細胞定位采用softberry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)；在UniProt網站上篩選下載Fv-GS6的同源序列，采用MEGA6軟件包[19](參數(shù)為bootstrap values 1000 resamplings)構建相應序列的鄰接法(Neighbor-Joining)系統(tǒng)進化樹.

1.6 fv-gs6表達量分析

采用OMEGA E.Z.N.A.Plant RNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，美國)提取樣品總RNA，采用TaKaRa PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa Bio Group，日本)合成cDNA.實時熒光定量PCR采用試劑BIO-RAD iTaq TM Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad，美國)，在實時熒光定量 PCR儀(Bio-Rad CFX96，美國) 上進行.實時熒光定量反應體系及程序參考所使用試劑盒的說明書.目標基因的相對表達量使用2-△△CT法進行計算處理.以金針菇Fv01-10甘油醛-3-磷酸脫氫酶編碼基因(GAPDH)為內參基因，引物序列如表1所示.

表1 實時熒光定量的引物序列Table 1 Primer sequence of quantitative real-time PCR

2 結果與分析

2.1 fv-gs6基因序列準確性驗證及結構分析

圖1 基因組Reads在fv-gs6序列上的定位情況Fig.1 Positioning of genomic reads on fv-gs6 sequence

Zoom lite軟件reads定位結果(圖1)顯示fv-gs6基因序列均有Fv01-10基因組reads覆蓋，且最低覆蓋的reads條數(shù)為54條，說明該基因的序列準確可信.

子實體不同生長發(fā)育階段及不同組織的轉錄組數(shù)據(jù)經過Zoom lite軟件reads定位表明，fv-gs6全長1 439 bp，含有9個外顯子，8個內含子(圖2)，編碼339個氨基酸.此結果符合“GT-AG”內含子剪切位置的原則.fv-gs6核酸序列信息已提交至Genbank，基因登錄號為MF457899.將該基因序列與Fv01-10基因組進行本地Blast，發(fā)現(xiàn)該序列僅定位到scaffold1上，位于3 610 934至3 609 496之間，推測其為單拷貝基因.

圖2 fv-gs6基因結構Fig.2 Gene structure of fv-gs6

2.2 Fv-GS6蛋白的生物信息學分析

Fv-GS6的結構域預測結果(圖3)表明該蛋白屬于糖苷水解酶家族(IPR017853).通過在UniProt網站上篩選下載雙孢蘑菇(Agaricusbisporus, Q9P8B3)等9種真菌β-1,6-葡聚糖合酶氨基酸序列進行基序分析，結果顯示β-1,6-葡聚糖合酶基序可以分為子囊菌和擔子菌兩大類，金針菇屬于擔子菌，其Fv-GS6基序歸屬于擔子菌、并且與雙孢蘑菇相似，支持金針菇Fv-GS6屬于β-1,6-葡聚糖合酶的推測(圖4).

圖3 Fv-GS6蛋白結構域Fig.3 Protein domain of Fv-GS6

1至5:Pochonia chlamydosporia (A0A179FS78), Metarhizium anisopliae (A0A0B4GPK3), Isaria fumosorosea (A0A167PLB3), Cordyceps confragosa (A0A168BJH5), Hypocrea jecorina (A0A024S1Z0). 6至10:Agaricus bisporus (Q9P8B3), Mycena chlorophos (A0A146HY51), Moniliophthora roreri (V2XTE5), Fv-GS6, Coprinopsis cinerea (A8NUV7).圖4 Fv-GS6和其它真菌中同源蛋白β-1,6-葡聚糖合酶的基序分析Fig.4 Motifs of Fv-GS6 and other fungal β-1, 6-glucan synthase homology proteins

利用在線軟件對fv-gs6編碼的蛋白進行信號肽預測，結果顯示該蛋白具有信號肽(圖5A)，預示著該蛋白可能通過內質網-高爾基體途徑，且通過信號肽切割位點剪切信號肽形成成熟的蛋白質，屬于分泌型蛋白；亞細胞定位結果(圖5B)也支持該蛋白位于細胞外.另外，跨膜結構預測結果顯示Fv-GS6蛋白沒有跨膜結構，不屬于跨膜蛋白(圖5C).

2.3 系統(tǒng)進化樹分析

通過在UniProt網站上篩選下載雙孢蘑菇(Agaricusbisporus, Q9P8B3)、灰蓋鬼傘(Coprinopsiscinerea, A8NUV7)、豆薯層銹菌(Phakopsorapachyrhizi, A0A0S1MIW1)、紅褐肉座菌 (Hypocreajecorina, A0A024S1Z0)等12個物種的β-1,6-葡聚糖合酶氨基酸序列，用MEGA6軟件包構建鄰接法(Neighbor-Joining)系統(tǒng)進化樹.結果(圖6)顯示擔子菌和子囊菌的β-1,6-葡聚糖合酶分別聚在兩個大分支上，擔子菌這一大分支中又可以分為兩小類，金針菇中的Fv-GS6蛋白與雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)聚在同一小分支上.Fv-GS6蛋白歸屬于擔子菌這一分支，它與基序的分析結果相一致.

A為Fv-GS6信號肽預測結果；B為Fv-GS6亞細胞定位結果；C為Fv-GS6跨膜結構預測結果.圖5 Fv-GS6信號肽(A)、亞細胞定位(B)及跨膜結構預測(C)結果Fig.5 Signal peptide (A), subcellular localization (B) and transmembrane structure prediction (C) of Fv-GS6

圖6 Fv-GS6系統(tǒng)發(fā)育進化分析Fig.6 Phylogeny analysis of Fv-GS6

2.4 fv-gs6在金針菇子實體各個生長發(fā)育階段表達量檢測

fv-gs6的qRT-PCR結果(圖7A)顯示：以原基時期的表達量為對照，fv-gs6在伸長期菌柄、伸長期菌蓋、成熟期菌柄、成熟期菌蓋的表達量分別是原基的97.94倍、0.38倍、64.15倍、0.08倍.在金針菇子實體生長發(fā)育階段，fv-gs6在菌柄的表達量遠高于在其它組織或發(fā)育階段的表達量，且在伸長期菌柄的表達量高于在成熟期菌柄的表達量，該結果說明fv-gs6可能在伸長期菌柄中發(fā)揮著比較重要的作用.對fv-gs6在金針菇菌柄伸長區(qū)段與非伸長區(qū)段的表達量進行檢測，qRT-PCR結果(圖7B)顯示fv-gs6在菌柄伸長區(qū)段的表達量是不伸長區(qū)段的5.42倍.結果表明fv-gs6的表達量與金針菇菌柄伸長速度呈正相關.

A為fv-gs6在金針菇子實體各個生長發(fā)育階段表達量；B為fv-gs6在金針菇菌柄不同伸長區(qū)段的表達量prm：原基，eln-stp：伸長期菌柄，eln-pls：伸長期菌蓋，mtr-stp：成熟期菌柄，mtr-pls：成熟期菌蓋，stp-eln：菌柄伸長區(qū)段，stp-sta：菌柄非伸長區(qū)段.圖7 fv-gs6在金針菇子實體中的表達量Fig7 Relative expression level of fv-gs6 in F.velutipes fruit body

3 討論

Humbel et al[20]通過抗體標記等方法，在釀酒酵母的高爾基體、小囊泡、細胞膜底層檢測到了β-1,6-葡聚糖的存在，推測β-1,6-葡聚糖的合成始于內質網，途經高爾基體，最后定位于細胞表面.本研究對Fv-GS6蛋白的信號肽、跨膜結構及亞細胞定位的分析顯示該蛋白具備完整的信號肽，且亞細胞定位結果顯示在細胞外，可以被分泌到細胞外合成并行使催化功能.有研究表明[20]，僅有少量的β-1,6-葡聚糖定位在細胞內，而絕大多數(shù)分布于細胞膜外；Montijn et al[21]的研究結果也顯示β-1,6-葡聚糖的合成大部分發(fā)生在細胞表面.據(jù)此推測：β-1,6-葡聚糖可能大部分在細胞外合成并直接用于組成細胞壁結構，僅有少部分在細胞內合成并通過內質網——高爾基體途徑被分泌到細胞外而發(fā)揮作用.

Gilbert et al[22]研究發(fā)現(xiàn)在新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)中，KRE(killer toxin resistant)家族的KRE5、KRE6與β-1,6-葡聚糖合成相關，具有維持細胞壁完整性等作用，在這些基因突變株中發(fā)現(xiàn)β-1,6-葡聚糖含量減少、生長速度減慢且表型異常.Mol et al[23]研究雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)時發(fā)現(xiàn)在菌柄快速伸長階段β-葡聚糖中由β-1,6-糖苷鍵連接的葡聚糖側鏈比重增加.Eastwood et al[24]研究表明，在雙孢蘑菇采收后，β-1,6-葡聚糖合酶的編碼基因的轉錄水平仍有所提高，Braaksma et al[25]研究表明，在雙孢蘑菇后熟階段菌柄、菌蓋、菌褶都有生長，推測β-1,6-葡聚糖合酶可能影響細胞壁成分變化.本研究結果顯示，fv-gs6在金針菇菌柄中高表達，在伸長期菌柄的表達量高于成熟期菌柄的表達量，且在菌柄伸長區(qū)段的表達量高于非伸長區(qū)段的表達量；推測該基因的高表達可以提高菌柄細胞β-1,6-葡聚糖的合成量，增加細胞壁合成速度，從而促進菌柄伸長.

致謝：國家食用菌品種改良中心福建分中心、福建省食用菌工程技術研究中心為本研究提供了試驗與分析條件，在此表示感謝!