劉曉東 彭利蘭 何勝梅 張 森 莘海亮 吳邦元*

(1. 黔東南民族職業(yè)技術學院，凱里556000；2.西華師范大學生命科學學院，西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，南充637009)

蛋氨酸與生物體內各種含硫化合物的代謝密切相關，參與新蛋白質的合成[1-2]。動物的快速生長常與蛋白質的合成速度呈正比例關系[3]，而蛋白質的合成也是腸道生長發(fā)育的重要基礎。氨基酸可促進腸道的生長發(fā)育，如4.82%支鏈氨基酸可促進肉雞腸道的生長發(fā)育[4]，外源谷氨酰胺的添加也可顯著促進肉仔雞早期腸道的生長發(fā)育[5]。此外，飼糧中粗蛋白質水平也可影響豬的生產性能以及胃腸道的發(fā)育[6]。因此，蛋氨酸可能對動物的腸道的生長發(fā)育有著重要的作用。

動物對蛋氨酸需要量因不同品種、不同日齡、不同生理狀態(tài)(如妊娠期、哺乳期以及幼仔期)以及不同性別而有差異。蛋氨酸供應不足將會導致動物生長性能以及生理功能受損。蛋氨酸缺乏會降低肉仔雞體重、食物攝入量和飼料轉化效率[7]，導致機體蛋白質合成減少[8]，影響細胞氧化功能[9]。蛋氨酸缺乏也會造成肉仔雞免疫器官受損[10-12]。除此之外，蛋氨酸缺乏也可影響心臟、肝臟等臟器某些酶的活性，引起嚴重的肝臟組織損傷[13]。然而，目前尚未見到蛋氨酸缺乏對腸道發(fā)育及其功能的研究。

腸道是機體接觸外界抗原物質最直接的部位，腸道具有消化和吸收營養(yǎng)物質、電解質以及吸收水的功能，也可以分泌一些酶及轉運蛋白，而管腔內黏膜系統(tǒng)屬于重要的機體免疫系統(tǒng)，對于機體防御機能具有重要作用[14]。已有研究指出，腸道的吸收功能與其形態(tài)學有著密切的相關性，任何形態(tài)學的改變都會導致腸道的功能受損[15-16]。因此，本試驗主要通過光學顯微鏡觀察小腸絨毛高度、隱窩深度，以及通過組織化學方法統(tǒng)計杯狀細胞的數量變化來研究蛋氨酸缺乏對肉仔雞小腸發(fā)育和功能的影響，為研究蛋氨酸對人及其他動物腸道功能的影響提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼糧和試驗動物

選取1日齡科寶(Cobb)肉雞健雛120只，體重為(45±5)g，購于四川省成都市溫江正大畜禽有限公司。使用玉米-豆粕型基礎飼糧作為對照組飼糧，試驗組飼糧為在基礎飼糧中不額外添加蛋氨酸。飼糧參照NRC肉雞營養(yǎng)標準配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kilogram of diets：VA 12 500 IU，VD32 500 IU，VE 18.75 IU，VK 5.0 mg，VB12.5 mg，VB27.5 mg，VB65.0 mg，VB120.002 5 mg，泛酸 pantothenate 15 mg，煙酸 niacin 50 mg，葉酸 folic acid 1.25 mg，生物素 biotin 0.12 mg，Cu 10 mg，Mn 100 mg，Zn 100 mg，Fe 100 mg，I 0.4 mg，Se 0.2 mg。

2)試驗組蛋氨酸含量為實測值，其他為計算值。Met contents in experimental group were measured values, while the others were calculated values.

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：4%多聚甲醛、各濃度梯度(50%、65%、70%、75%、85%、90%、95%和100%)酒精、蘇木精、伊紅、過碘酸和Schiff染液等。

主要儀器：石蠟切片機(LEICA，KD-2258，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，中國)、光學顯微鏡(OLMPUS，BA410，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，中國)、顯微攝相系統(tǒng)(MoticamPro205A，尼康，日本)和Image Pro Plus v6.0(中國)等。

1.3 試驗設計

1.3.1 動物分組及飼養(yǎng)管理

將120只肉仔雞隨機分為2組，每組6個重復，每個重復10只雞，其中每組的1個重復用于全程觀察。試驗期間2組肉仔雞分別飼喂基礎飼糧和蛋氨酸缺乏飼糧，飼養(yǎng)于不銹鋼制試驗禽籠內，每個重復1個籠子，自由飲水和采食，其他飼養(yǎng)管理方式與常規(guī)育雛方案一致，試驗期42 d。采樣時間點為第14、28和42天。

1.3.2 組織學觀察

分別于試驗第14、28和42天，各組隨機選取5只雞剖殺，取十二指腸、空腸和回腸中段約1 cm的組織樣，置于4%多聚甲醛中固定，經流水沖洗后，再使用75%、85%、95%和100%的酒精進行各級脫水，之后用甲苯進行透明處理，最后將樣品進行浸蠟、包埋處理，再將樣品切成5 μm厚的薄片進行貼片，再經蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下觀察、拍照，從組織切片上選10個典型視野(絨毛完整、走向平直)，測量小腸絨毛高度和隱窩深度，其平均值作為測定數據并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.3.3 小腸杯狀細胞組織化學觀察

樣品采集及切片制作方法同小腸組織學觀察，染色方法用過碘酸希夫-阿利新藍染色法。

染色步驟如下：常規(guī)石蠟切片至水洗；阿利新藍液染色5 min(滴染)；自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗；過碘酸液染2～5 min，水洗；Schiff染液染30 min(或多)，水洗10 min(細水流沖洗)；可選用明礬蘇木精復染1 min左右，分化，藍化；最后水洗、脫水、透明、封片。

染色結果為杯狀細胞呈藍色(酸性黏蛋白)、品紅色(含中性黏蛋白)及藍紅混合色(含酸中性黏蛋白混合物)。

顯微照相，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進行杯狀細胞計數。方法如下：每只雞各腸段分別取5張過碘酸希夫-阿利新藍染色的石蠟切片，每張切片隨機取5個視野，統(tǒng)計杯狀細胞的數目，計數結果采用Excel 2007進行統(tǒng)計學分析。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

試驗數據采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組數據均以平均值±標準差表示，并用獨立樣本t檢驗分析法比較試驗組與對照組間差異的顯著性,其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 蛋氨酸缺乏對肉仔雞小腸形態(tài)結構的影響

2.1.1 蛋氨酸缺乏對肉仔雞十二指腸形態(tài)結構的影響

由表2可知，28和42日齡時，與對照組相比，試驗組肉仔雞十二指腸絨毛高度顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；14、28和42日齡時，試驗組肉仔雞十二指腸隱窩深度均顯著降低(P<0.05)；42日齡時，試驗組肉仔雞十二指腸V/C值也顯著降低(P<0.05)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下表同。

* mean significantly different compared with the control group (P<0.05), ** mean extremely significantly different compared with the control group (P<0.01). The same as below.

2.1.2 蛋氨酸缺乏對肉仔雞空腸形態(tài)結構的影響

由表3可知，蛋氨酸缺乏對肉仔雞空腸形態(tài)結構的影響變化趨勢與十二指腸相似。14、28和42日齡時，與對照組相比，試驗組肉仔雞空腸絨毛高度顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；42日齡時，試驗組肉仔雞空腸隱窩深度也極顯著低于對照組(P<0.01)；28和42日齡時，試驗組肉仔雞空腸V/C值與對照組相比顯著降低(P<0.05)。

表3 蛋氨酸缺乏對肉仔雞空腸形態(tài)結構的影響

2.1.3 蛋氨酸缺乏對肉仔雞回腸形態(tài)結構的影響

由表4可知，14、28和42日齡時，與對照組相比，試驗組肉仔雞回腸絨毛高度均極顯著降低(P<0.01)，而隱窩深度也顯著或極顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01)；14和42日齡時，試驗組肉仔雞回腸V/C值與對照組相比顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表4 蛋氨酸缺乏對肉仔雞回腸形態(tài)結構的影響

2.2 蛋氨酸缺乏對肉仔雞小腸杯狀細胞數量的影響

組織化學檢測結果表明杯狀細胞主要分布在小腸絨毛上皮細胞之間(圖1～圖3)和隱窩內(圖4～圖6)。

如圖1所示，28和42日齡時，與對照組相比，試驗組十二指腸絨毛上皮細胞間的杯狀細胞數量呈顯著或極顯著減少(P<0.05或P<0.01)；如圖2所示，42日齡時，與對照組相比，試驗組空腸絨毛上皮細胞間的杯狀細胞數量極顯著減少(P<0.01)；如圖3所示，42日齡時，試驗組回腸絨毛上皮細胞間的杯狀細胞數量顯著減少(P<0.05)。

如圖4所示，42日齡時，與對照組相比，試驗組十二指腸隱窩間的杯狀細胞數量極顯著減少(P<0.01)；如圖5所示，28和42日齡時，試驗組空腸隱窩間的杯狀細胞數量顯著或極顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01)；如圖6所示，42日齡時，與對照組相比，試驗組回腸隱窩間的杯狀細胞也極顯著減少(P<0.01)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

* mean significantly different compared with the control group (P<0.05), ** mean extremely significantly different compared with the control group (P<0.01). The same as below.

圖1十二指腸絨毛上皮細胞間杯狀細胞

Fig.1 Goblet cells among epithelial cells of duodenal villi (400×)

圖2 空腸絨毛上皮細胞間杯狀細胞

圖3 回腸絨毛上皮細胞間杯狀細胞

3 討 論

腸道作為內環(huán)境與外環(huán)境相通的關鍵部位，具有十分重要的功能，尤其是小腸黏膜具有免疫屏障功能，可防止腸道微生物和其他毒素對腸道的侵襲，并且小腸作為動物重要的消化吸收器官，具有消化吸收營養(yǎng)物質、礦物質鹽以及吸收水的功能[17]。小腸絨毛的完整性決定了其消化吸收的能力[18]，同時可以保護機體，防止機體吸收有害物質。據研究顯示，飼糧中蛋氨酸的增加有助于維持斷奶仔豬小腸黏膜的屏障功能[19-21]。本研究發(fā)現，蛋氨酸缺乏會導致腸道發(fā)育受阻以及腸道屏障功能受損，主要表現在小腸絨毛高度、隱窩深度以及V/C值降低，小腸杯狀細胞數量減少。

腸道內環(huán)境的直接表現為絨毛高度、隱窩深度和V/C值，這幾項指標是反映腸道健康的重要參數。有研究已證實V/C值是評價機體腸道發(fā)育狀態(tài)的可靠指標[22]。本研究發(fā)現，飼糧中蛋氨酸缺乏會對十二指腸、空腸和回腸絨毛細胞產生負面效應，包括絨毛高度縮短、隱窩深度降低以及V/C值降低。研究表明，絨毛高度的增加與腸道消化吸收功能增強密切有關，絨毛高度增加相當于增加了小腸消化吸收的表面積，從而使它的刷狀緣酶表達活性增加，營養(yǎng)物質運輸功能也隨之增強[23-24]。所以我們推測，蛋氨酸缺乏可能會影響腸道刷狀緣酶表達活性以及影響營養(yǎng)物質新陳代謝等，最終使腸道相關營養(yǎng)物質的轉運和消化吸收能力減弱。此結果表明蛋氨酸缺乏會使小腸的結構受損，導致小腸的生長發(fā)育受阻，動物消化吸收營養(yǎng)物質的能力受到抑制，從而降低了動物生長性能和影響動物的正常生長發(fā)育。除此之外，因為腸道中有黏膜免疫系統(tǒng)并包含多種參與免疫機制的免疫細胞，所以蛋氨酸缺乏亦可能影響免疫功能。

圖4 十二指腸隱窩間杯狀細胞

圖5 空腸隱窩間杯狀細胞

圖6 回腸隱窩間杯狀細胞

杯狀細胞廣泛的分布于腸道上皮細胞之間，并可分泌黏液[25-26]，其可合成和分泌大分子量的糖類復合物——黏蛋白[27-28]。黏蛋白是一種糖蛋白，釋入管腔內成為潤滑性黏液涂布于上皮表面，對上皮具有保護作用，是保護腸道完整性和健康的第1道屏障[29-30]。我們的研究結果顯示，蛋氨酸缺乏組的杯狀細胞數量在十二指腸、空腸和回腸各段均顯著低于對照組。而腸道上皮細胞間杯狀細胞的數量變化與腸段、飲食習慣、飼養(yǎng)管理、病原體侵入、個體發(fā)育階段以及物種種類密切相關[27]。在本研究中，通過對比蛋氨酸缺乏組與對照組的試驗結果，我們推測小腸杯狀細胞數量的減少可能也與蛋白質缺乏有關(動物合成蛋白質的起始氨基酸均為蛋氨酸)，并已有試驗指出虹鱒魚飼糧中提高植物蛋白質水平會使腸道中杯狀細胞數量增加[30]。通過本次研究表明，蛋氨酸缺乏會減少肉仔雞小腸杯狀細胞數量，對杯狀細胞分泌黏蛋白產生負面效應，最終改變黏液層中黏蛋白的結構組成及其理化性質[31]，說明小腸黏液層的保護功能降低，腸道的屏障功能受損。而黏蛋白導致的腸道屏障功能受損會影響腸道上皮細胞緊密連接的通透性、免疫調節(jié)系統(tǒng)等方面，從而會促使許多腸道疾病如炎癥性、潰瘍性和腫瘤性疾病的發(fā)生[32]。

4 結 論

蛋氨酸缺乏會造成肉仔雞小腸(十二指腸、空腸和回腸)絨毛高度、隱窩深度以及V/C值降低，并且導致杯狀細胞數量減少。這表明蛋氨酸缺乏時小腸正常發(fā)育會受到阻礙，其功能也會受損。