馬麗花， 劉保生， 邊 剛， 王春丹， 張紅彩， 程 旭

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 保定 071002)

1 引 言

目前探究藥物與蛋白反應(yīng)機(jī)理的方法主要考察激發(fā)波長(zhǎng)280,295 nm處隨著藥物濃度改變蛋白熒光猝滅的情況，是研究藥物與蛋白的整體作用[1]。同步熒光法兼具良好選擇性、高靈敏度、窄化譜帶和減小散射干擾等優(yōu)點(diǎn)[2]。在藥物與蛋白反應(yīng)機(jī)理的研究中，同步熒光法主要用于通過(guò)同步熒光峰的位移情況[3]考察蛋白構(gòu)象的變化。而通過(guò)控制發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)差，利用同步熒光法來(lái)研究藥物分別與蛋白分子中酪氨酸殘基(Tyr)和色氨酸殘基(Trp)的相互作用機(jī)理、熒光猝滅比率份數(shù)、結(jié)合率、結(jié)合模型等，進(jìn)而在更深層次上揭示藥物分子和蛋白反應(yīng)機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。考察藥物與蛋白中Tyr和Trp的反應(yīng)機(jī)理對(duì)于更加深入地研究藥物的藥理、藥效等有著重要的意義，同時(shí)Tyr和Trp含量的變化也可以揭示某些重大疾病的發(fā)生與發(fā)展情況。有研究表明，腫瘤病人血漿里游離Tyr和Trp的含量減少和腫瘤惡化情況有關(guān)[4]，二者可能在人體組織病變中產(chǎn)生了變化。該研究對(duì)于治療惡性腫瘤靶向藥物的開(kāi)發(fā)及其藥理、毒理等的研究，也具有一定的指導(dǎo)意義。

硝苯地平(NDP)又稱(chēng)尼非地平、利血平等，是二氫吡啶類(lèi)鈣通道阻滯劑的代表，多用于預(yù)防和治療心絞痛和冠心病，對(duì)于各種類(lèi)型的高血壓均有較好的療效[5]。胃蛋白酶(PEP)為人體內(nèi)主要的消化酶，主要存在于胃液中。當(dāng)NDP被口服后，與胃蛋白酶的結(jié)合可能會(huì)影響藥物的濃度[6]及PEP的游離濃度。胃蛋白酶與多種藥物的相互作用已有相關(guān)報(bào)道[7]，但尚未見(jiàn)與NDP之間相互作用的研究，本文以同步熒光法研究了NDP與PEP之間的相互作用，以期為蛋白與藥物結(jié)合的研究和NDP臨床用藥的把控提供更直觀細(xì)致的參考。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)試劑：胃蛋白酶(PEP，純度≥99%，Sigma公司) 儲(chǔ)備液5.0×10-5mol/L；硝苯地平(NDP，純度>99.8%)用少量無(wú)水乙醇溶解，以二次水配成1.15×10-4mol/L儲(chǔ)備液；pH=2.0的HAC-NaAc緩沖溶液(含0.10 mol/L NaCl)。實(shí)驗(yàn)用水皆為二次石英蒸餾水，以上儲(chǔ)備液于4 ℃下避光保存。

實(shí)驗(yàn)儀器：島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(配有1 cm寬度石英比色皿)與UV-3600紫外分光光度計(jì)； SYC-15B超級(jí)恒溫水??；SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器。

實(shí)驗(yàn)中所測(cè)熒光強(qiáng)度均采用“內(nèi)濾光效應(yīng)”公式進(jìn)行校正[8]：Icor=Iobs×e(Aex+Aem)/2。所用的乙醇濃度均于相同實(shí)驗(yàn)條件下做空白對(duì)比，對(duì)蛋白熒光光譜無(wú)影響。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.0 mL HAC-NaAc緩沖溶液、1.0 mL 2.0×10-5mol/L的PEP溶液及不同體積的NDP溶液，于一系列10 mL比色管中依序加入并以水定容，搖勻，分別在303，310，318 K恒溫水浴30 min。光度計(jì)狹縫寬度5 nm，固定Δλ=λem-λex=15 nm或60 nm，掃描同步熒光光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 猝滅機(jī)理與結(jié)合情況

圖1為Δλ=15 nm、60 nm時(shí)NDP與P-Tyr、P-Trp反應(yīng)的同步熒光光譜。NDP的加入分別使P-Tyr、P-Trp的熒光依次猝滅，說(shuō)明NDP與P-Tyr、P-Trp均發(fā)生了相互作用。Δλ=60 nm的同步熒光光譜發(fā)生了微弱的紅移，表明NDP使P-Trp周?chē)奈h(huán)境極性增強(qiáng)，疏水性減弱[9]。

猝滅劑與熒光體之間的猝滅方式可以簡(jiǎn)單地分作靜態(tài)與動(dòng)態(tài)猝滅，也有二者都存在的情況。單一猝滅機(jī)制的Stern-Volmer圖上應(yīng)是直線，由其對(duì)溫度的相關(guān)性可以區(qū)分其作用機(jī)制。而靜態(tài)與動(dòng)態(tài)聯(lián)合作用的情況下則是彎向Y軸的曲線。動(dòng)態(tài)猝滅可由Stern-Volmer方程得出猝滅速率常數(shù)Kq和Stern-Volmer猝滅常數(shù)Ksv[10]：

I0/I=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]，

(1)

其中I0和I分別為無(wú)有猝滅劑的熒光強(qiáng)度；τ0是分子熒光平均壽命(～10-8s)，[Q]是添加的藥物濃度。以I0/I對(duì)[Q]作圖，得出Ksv、Kq列于表1。表1中的數(shù)據(jù)表明：I0/I對(duì)[Q]具有良好的線性，而Ksv與Kq均隨溫度上升而增大，說(shuō)明NDP猝滅P-Tyr、P-Trp熒光的方式應(yīng)為動(dòng)態(tài)猝滅[11]，即NDP分子與PEP分子彼此擴(kuò)散和碰撞，從而使PEP的內(nèi)源熒光猝滅。

蛋白-藥物體系的表觀結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可以由下式求得[12]：

(2)

其中[Bt]為蛋白濃度。計(jì)算結(jié)果Ka與n皆列于表1。由表1可知，Ka隨溫度上升而明顯增大，也表明NDP對(duì)P-Tyr、P-Trp的猝滅方式是動(dòng)態(tài)猝滅。3個(gè)溫度下NDP對(duì)P-Tyr、P-Trp反應(yīng)的n值都約為1，表明藥物與蛋白反應(yīng)只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[13]，Δλ=15 nm時(shí)的Ka值明顯小于Δλ=60 nm的Ka值，表明NDP與P-Trp反應(yīng)程度更強(qiáng)。

CPEP=2.0×10-6 mol/L; 1～12: CNDP=(0, 0.58, 1.15, 1.73, 2.30, 3.46, 4.04, 4.62, 5.20, 5.77, 6.35, 6.93)×10-5 mol/L.

表1 NDP對(duì)P-Tyr、P-Trp體系的同步熒光猝滅反應(yīng)參數(shù)

r1為方程I0/I-[Q]的線性相關(guān)系數(shù)；r2為方程lg[(I0-I)/I]-lg{[Q]-n[Bt]I0-I)/I0}的線性相關(guān)系數(shù)。

3.2 氨基酸殘基熒光猝滅比率份數(shù)與蛋白結(jié)合率

以猝滅比率RSFQ表示同步熒光強(qiáng)度降低的程度，RSFQ=1-I/I0[14]，在相同溫度和藥物濃度時(shí)分別計(jì)算RSFQ(P-Tyr)、RSFQ(P-Trp)值，定義NSFQR(P-Tyr)=(RSFQ(P-Tyr)/(RSFQ(P-Tyr)+RSFQ(P-Trp))×100%為該條件下的P-Tyr熒光猝滅比率份數(shù)，則P-Trp的熒光猝滅比率份數(shù)NSFQR(P-Trp)=100%-NSFQR(P-Tyr)。取310 K下CNDP/CPEP=(5.8，8.7，14.4，20.2，23.1，28.9)時(shí)的NSFQR(P-Tyr)分別為42.18%、45.22%、45.90%、46.32%、47.74%、49.31%，平均值為45.66%，NSFQR(P-Trp)分別為57.82%、54.88%、54.10%、53.67%、53.34%、52.26%，平均值為54.34%。說(shuō)明P-Tyr與P-Trp均參與了反應(yīng)，且NSFQR(P-Trp)>NSFQR(P-Tyr)，說(shuō)明反應(yīng)位置應(yīng)更接近P-Trp，證明了3.1的結(jié)論。

藥物蛋白結(jié)合率是評(píng)估其藥性與藥效不可或缺的指標(biāo)。以表1所得Ka計(jì)算NDP與P-Tyr、P-Trp的蛋白結(jié)合率。n=1時(shí)，結(jié)合率(W)公式如下[15]：

(3)

KaR[B0]W2-(KaR[B0]+Ka[B0]+1)W+Ka[B0]=0,

(4)

其中[B0]為蛋白總濃度(～10-3mol/L)，NDP濃度在1.0×10-7～1.0×10-3mol/L之間，R為藥物濃度與蛋白總濃度之比。經(jīng)計(jì)算得298,310,318 K時(shí)NDP與P-Tyr的蛋白結(jié)合率分別為66.76%～84.68%、69.43%～87.15%、71.04%～88.53%，NDP與P-Trp的蛋白結(jié)合率分別為72.22%～89.50%、73.64%～90.60%、74.91%～91.53%。顯然隨著溫度的上升，NDP與P-Tyr、P-Trp的蛋白結(jié)合率都分別增大。根據(jù)式(4)做出蛋白結(jié)合率W與濃度比R的曲線圖如圖2。對(duì)310 K時(shí)的曲線進(jìn)行非線性擬合得NDP與P-Tyr結(jié)合模型為：W=-0.1109R2+0.07492R+0.8799，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9；NDP與P-Trp的結(jié)合模型為：W=-0.1398R2-0.03372R+0.9096，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。表明當(dāng)?shù)鞍诐舛纫欢〞r(shí)，藥物濃度增加會(huì)減少其蛋白結(jié)合率。NDP與兩種氨基酸殘基的蛋白結(jié)合率均在90%以上，與NDP實(shí)際蛋白結(jié)合率92%～98%[16]相近，該結(jié)果為NDP的臨床用藥提供了參考，也表明熒光法能夠?yàn)橛?jì)算藥物與蛋白結(jié)合時(shí)蛋白結(jié)合率提供一種簡(jiǎn)便易行的方法。

圖2 不同溫度下的NDP對(duì)P-Tyr、P-Trp蛋白結(jié)合率。(a)Δλ=15 nm；(b)Δλ=60 nm)。

3.3 作用力與藥物協(xié)同性考察

熱力學(xué)參數(shù)焓變?chǔ)、熵變?chǔ)、吉布斯自由能變化ΔG可由以下方程求得，以分辨藥物與蛋白分子相互作用的情況：

RlnKa=ΔS-ΔH/T，

(5)

ΔG=ΔH-TΔS，

(6)

其中R為理想氣體常數(shù)，T為溫度，Ka為表觀結(jié)合常數(shù)，得出蛋白與藥物間各項(xiàng)熱力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 不同溫度下NDP -P-Tyr、NDP -P-Trp體系的熱力學(xué)參數(shù)

由表2可知NDP與P-Tyr、P-Trp相互作用的ΔG均小于0，表明該過(guò)程為自發(fā)過(guò)程；ΔH均大于0，表明NDP與P-Tyr、P-Trp相互作用均為吸熱反應(yīng)且Δλ=15 nm的ΔH大于Δλ=60 nm，說(shuō)明NDP與P-Tyr反應(yīng)需要更多外來(lái)能量，高溫時(shí)對(duì)NDP與P-Tyr的反應(yīng)更有利，而低溫時(shí)NDP與P-Trp反應(yīng)更容易進(jìn)行。ΔH與ΔS均為正值，表明NDP與P-Tyr、P-Trp作用力以疏水作用為主[17]。

考察藥物協(xié)同性可使用Hill方程[18]：

lgL/(Lm-L)=lgKa+nHlg[Q]，

(7)

式中L=1-I/I0，Lm通過(guò)1/L對(duì)1/[Q]畫(huà)圖得到，nH為Hill系數(shù)。nH>1是正協(xié)同作用，nH<1是負(fù)協(xié)同作用，nH=1則是無(wú)協(xié)同作用，nH結(jié)果見(jiàn)表3。從表中數(shù)據(jù)可知，nH都約為1，說(shuō)明NDP與P-Tyr或P-Trp的作用將不影響后繼配體與蛋白的結(jié)合，表現(xiàn)為零協(xié)同作用，且不受溫度的影響。

表3 NDP-P-Tyr、NDP-P-Trp體系的nH值

nH為體系的Hill系數(shù)；r3為方程lg[L/(Lm-L)]-lg[Q]的線性相關(guān)系數(shù)。

3.4 NDP-P-Tyr、NDP-P-Trp間的距離

由F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，根據(jù)以下公式[19]：

(8)

(9)

(10)

其中K2=2/3，N=1.336，Φ=0.15。 P-Tyr或P-Trp的同步熒光光譜與NDP的紫外吸收光譜見(jiàn)圖3。通過(guò)公式計(jì)算依次得到表4中結(jié)果。

從表4可以看出：r均小于7 nm，說(shuō)明NDP與P-Trp、P-Tyr間都存在非輻射能量轉(zhuǎn)移[20]。而Δλ=15 nm時(shí)的R0、r均大于Δλ=60 nm時(shí)的R0、r，意味著NDP分子到P-Trp的作用距離更短，更容易使P-Trp的熒光發(fā)生猝滅。隨著溫度的升高，E值都逐漸增加且r值逐漸減小，說(shuō)明溫度的上升使NDP分子與PEP分子間碰撞加劇，反應(yīng)速率加快，也表明NDP與P-Trp、P-Tyr的猝滅方式是動(dòng)態(tài)猝滅，與3.1中的結(jié)論相同。

圖3 A:PEP的同步熒光光譜(Δλ=15 nm);B:PEP的同步熒光光譜(Δλ=60 nm);C:NDP的紫外吸收光譜(T=298 K,CNDP=CPEP=2.0×10-6 mol/L)。

表4 不同溫度下NDP-P-Tyr、NDP-P-Trp體系之間的結(jié)合參數(shù)

4 結(jié) 論

常規(guī)的熒光猝滅法只能探究蛋白-藥物體系的整體性質(zhì)如結(jié)合常數(shù)、作用力、結(jié)合距離等。而通過(guò)固定Δλ=15 nm、Δλ=60 nm，利用同步熒光法可以直接得到藥物與蛋白色氨酸殘基、酪氨酸殘基之間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、作用力、結(jié)合率、結(jié)合模型、結(jié)合距離及結(jié)合程度等。該研究對(duì)更加深入地研究藥物與蛋白的作用機(jī)制及蛋白在與藥物分子結(jié)合中的結(jié)合行為均有著重要的意義。