張曉旭，周錫欽，嚴(yán)江，劉紅芹*，徐寶財(cái)

(1.北京工商大學(xué) 食品學(xué)院 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品添加劑與配料北京工程研究中心，北京 100048；2.北京味食源食品科技有限責(zé)任公司，北京 101200)

辣椒提取物辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素等不僅可以作為食品添加劑，還可以應(yīng)用到醫(yī)藥和軍事等領(lǐng)域[1-3]。我國(guó)目前對(duì)辣椒堿和辣椒二氫堿等有效成分的提取還處于初級(jí)階段，由于生產(chǎn)規(guī)模小，工藝設(shè)備落后，導(dǎo)致辣椒在我國(guó)的深加工及市場(chǎng)應(yīng)用方面一直比較低迷。目前，酶法提取已廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取，如酶法提取脂肪酸和黃酮等[4-6]。

然而，由于酶促反應(yīng)涉及的步驟增加及后處理導(dǎo)致的成本增加，使得酶促反應(yīng)的工業(yè)應(yīng)用受到一定限制。研究表明，酶促反應(yīng)中添加表面活性劑，不僅可以提高酶的水解速率，還可以降低酶的負(fù)載[7-9]。目前，表面活性劑輔助酶解技術(shù)很少涉及食品工業(yè)。本文利用酶和表面活性劑輔助提取辣椒中的辣椒堿、辣椒二氫堿、辣椒紅色素，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，考察酶和表面活性劑添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間等對(duì)其提取率的影響規(guī)律，為辣椒的精加工和綜合利用提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣椒 北京味食源食品有限公司；辣椒堿、辣椒二氫堿、辣椒紅色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(≥98%) Dr.Ehrenstorfer GmbH；纖維素酶(酶活力50000 U/g) 河南亞通食品原料有限公司；乙醇(分析純)、甲醇(色譜純) 北京化工廠；食品級(jí)硬脂酰乳酸鈣(CSL)、硬脂酰乳酸鈉(SSL)、吐溫-80和司潘-60 濟(jì)南蘭欣生物技術(shù)有限公司。

1200型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；UV Vis Spectrophotometer(UV-3600) 北京瑞麗分析儀器有限公司；高速萬能破碎機(jī)(DGF-100) 黃陂解放儀器廠；電子天平(FA1004N) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；電加熱水浴鍋(DY-H) 上海圣奇儀器有限公司；高速離心機(jī)(TG16) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；KQ-250D 超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒堿和辣椒二氫堿的提取

辣椒去籽，粉碎，稱取5.0 g，加入40 mL蒸餾水和0.3%(W/W)的纖維素酶，50 ℃反應(yīng)2 h后進(jìn)行離心分離，取上清液，殘?jiān)眉状寂c四氫呋喃的混合溶液(1∶1，V/V)進(jìn)行超聲提取，溫度60 ℃，功率70 W，提取時(shí)間1 h，過濾，得到包含辣椒堿和辣椒二氫堿的濾液。

1.2.2 辣椒紅色素的提取

辣椒去籽，粉碎過篩，稱取 5.0 g，加入40 mL蒸餾水和0.2% (W/W)的纖維素酶，50 ℃反應(yīng)2 h后進(jìn)行離心分離，取上清液，殘?jiān)?0 mL丙酮浸提劑，超聲提取30 min，過濾，得到包含辣椒紅色素的濾液。

1.2.3 繪制辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 辣椒堿(A)、辣椒二氫堿(B)和辣椒紅色素(C)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用甲醇和四氫呋喃的混合溶液1∶1(V/V)配制濃度分別為0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 mg/mL的辣椒堿標(biāo)品溶液，進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)測(cè)定，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1中A)：辣椒堿在0.01～0.5 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=4270.6x-10.564，r2=0.9999。

1.2.4 繪制辣椒二氫堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

用甲醇和四氫呋喃的混合溶液1∶1(V/V)配制濃度分別為0.004，0.021，0.034，0.052，0.170 mg/mL的辣椒二氫堿標(biāo)品溶液，進(jìn)行HPLC測(cè)定，以標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1中B)：辣椒二氫堿在0.0042～0.170 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=3363.8x+4.2657，r2=0.9996。

1.2.5 繪制辣椒紅色素標(biāo)準(zhǔn)曲線

用丙酮配制濃度分別為0.38，0.33，0.29，0.23，0.046，0.033 mg/mL的辣椒紅色素標(biāo)品溶液，以丙酮作參比，于波長(zhǎng)460 nm 處測(cè)吸光度，以標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1中C)：辣椒紅色素在0.033～0.38 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=5.5226x-0.0112，r2=0.9999。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 辣椒堿和辣椒二氫堿的測(cè)定

以HPLC法測(cè)定其含量，色譜條件：色譜柱為反相C18柱(15 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為甲醇∶水為80∶20(V/V)，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為760 nm，進(jìn)樣體積為10 μL。辣椒堿、辣椒二氫堿的含量采用面積外標(biāo)法計(jì)算。

1.3.2 辣椒紅色素的測(cè)定

利用紫外可見分光光度計(jì)在460 nm處測(cè)量辣椒素含量。辣椒紅色素的含量采用面積外標(biāo)法計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，分析纖維素酶添加量、料液比、酶解時(shí)間、酶解溫度、辣椒粒度、表面活性劑類型和表面活性劑添加量這7個(gè)因素對(duì)提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響。

2.1.1 酶添加量對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

固定酶解時(shí)間為2 h，酶解溫度為50 ℃，料液比為1∶8 (g/mL)，試驗(yàn)考察了纖維素酶添加量對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 添加酶與空白組對(duì)比(A)、酶添加量(B)、料液比(C)和酶解時(shí)間(D)對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素含量的影響

由圖2中A可知，添加酶的試驗(yàn)組中，辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素的含量均較空白組高。且由圖2中B可知，3種物質(zhì)的含量隨酶添加量的增大而增大，在酶添加量為0.3%(W/W)時(shí)，辣椒堿、辣椒二氫堿的含量達(dá)到最大值。在酶添加量為0.2%(W/W)時(shí)，辣椒紅色素的含量達(dá)到最大。分析原因可能是，當(dāng)酶添加量較低時(shí)，底物過量，酶解不完全，致使辣椒中的有效成分溶出率不高，隨著酶添加量的增加，酶解作用增加，辣椒中關(guān)鍵物質(zhì)的溶出率也隨著增加，而當(dāng)酶添加過量時(shí)，由于酶與底物的結(jié)合飽和，3種物質(zhì)的含量不會(huì)繼續(xù)增長(zhǎng)。

2.1.2 料液比對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

分別固定纖維素酶添加量為0.3%(辣椒堿、辣椒二氫堿的提取試驗(yàn))和0.2%(辣椒紅色素的提取試驗(yàn))，其他條件保持不變，試驗(yàn)考察了料液比對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2中C。

由圖2中C可知，隨著料液比的增加，辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的含量先增加后降低。當(dāng)料液比較低時(shí)，反應(yīng)體系的粘度降低，有利于底物的水解，使辣椒細(xì)胞中有效物質(zhì)的擴(kuò)散增加，反應(yīng)更加充分。隨著料液比的進(jìn)一步增加，酶的濃度大大降低，不利于酶與底物的緊密接觸，從而降低了底物的水解率，關(guān)鍵物質(zhì)的提取率也隨之降低。因此，提取辣椒堿和辣椒二氫堿的最佳料液比為1∶8(g/mL)，提取辣椒紅色素的最佳料液比為1∶7(g/mL)。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

在最適酶添加量和料液比的試驗(yàn)條件下，其他條件不變，試驗(yàn)考察了酶解時(shí)間對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2中D。

由圖2中D可知，隨著酶解時(shí)間的增加，辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的含量先增加后降低。原因可能是，隨著時(shí)間的增加，酶解反應(yīng)充分，有利于辣椒細(xì)胞中關(guān)鍵物質(zhì)的溶出，而當(dāng)酶解時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，辣椒中的辣椒堿和辣椒二氫堿等有效物質(zhì)會(huì)有一部分分解，導(dǎo)致其含量降低。綜合比較，提取辣椒堿和辣椒二氫堿的最適酶解時(shí)間為3 h，提取辣椒紅色素的最適酶解時(shí)間為2 h。

2.1.4 酶解溫度對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

圖3 酶解溫度(A)和辣椒粒度(B)對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素含量的影響

在酶解時(shí)間、酶添加量和料液比均為上述試驗(yàn)中的最佳條件下，試驗(yàn)考察了酶解溫度對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖3中A。

由圖3中A可知，隨著酶解時(shí)間的增加，辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的含量先增加后降低。原因可能是，溫度與酶解時(shí)間有關(guān)，酶解時(shí)間短，失活不明顯，最佳溫度較高；反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，最佳溫度越低。由于這種關(guān)系，酶的最適溫度只有在一定條件下才有意義，同時(shí)由于溫度過高，會(huì)導(dǎo)致部分酶失活。因此，確定提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的最適酶解溫度均為50 ℃。

2.1.5 辣椒粒度對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

固定酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間和料液比均為上述試驗(yàn)的最佳條件下，試驗(yàn)考察了辣椒粒度對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖3中B。

由3中B可知，3種物質(zhì)的含量均隨著粒度的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，其原因可能是材料破碎后，顆粒尺寸變小，表面能增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)浸出速度增加。但是，隨著物料粒度的進(jìn)一步減小，樣品粉末的表面積過大，吸附效果增強(qiáng)，不利于細(xì)胞中物質(zhì)的浸出。綜合分析，確定提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的最佳粒度為100目。

2.1.6 表面活性劑對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素含量的影響

圖4 表面活性劑種類(A)和SSL添加量(B)對(duì)辣椒堿、辣椒二氫堿和辣椒紅色素含量的影響

試驗(yàn)表明，在酶反應(yīng)過程中加入表面活性劑可以提高酶解效率。表面活性劑的存在可以通過減少“更多的剩余表面”來減少溶液的表面張力，且可以防止纖維素酶與空氣表面接觸并穩(wěn)定纖維素酶的活性[10]。此外，在膠束體系中，疏水性底物將被隔離在表面活性劑分子的聚集體內(nèi)，并且可用于酶催化水解反應(yīng)的有效底物濃度將不等于總底物濃度，可與酶相互作用的底物濃度也將取決于表面活性劑的性質(zhì)、底物與表面活性劑的比例以及其他反應(yīng)條件，如pH和溫度。同時(shí)，由于膠束表面的吸附或解吸，活性表面活性劑的濃度也會(huì)因不同的表面活性劑而變化[11]。因此，本文考察了酶解反應(yīng)中添加硬脂酰乳酸鈉(SSL)、硬脂酰乳酸鈣(CSL)、吐溫-80和司潘-60等表面活性劑對(duì)3種物質(zhì)提取率的影響，每種表面活性劑的加入量約為0.5%(W/W)，研究結(jié)果見圖4中A。由圖4中A可知，添加SSL的時(shí)候，3種物質(zhì)的提取含量均達(dá)到最大。因此，本試驗(yàn)對(duì)SSL 的添加量做了進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖4中B。由圖4中B可知，提取辣椒堿、辣椒二氫堿的SSL的最佳添加量為0.4%(W/W)，提取辣椒紅色素的SSL的最佳添加量為0.3%(W/W)。

2.2 正交試驗(yàn)

為了更科學(xué)合理地確定提取辣椒堿、辣椒二氫堿及辣椒紅色素的最優(yōu)工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用L18(36)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表和試驗(yàn)結(jié)果分析表分別見表1和表2。

表1 提取辣椒堿和辣椒二氫堿的正交試驗(yàn)的因素水平表

表2 提取辣椒堿和辣椒二氫堿的正交試驗(yàn)的結(jié)果分析表

由表2可知，各因素對(duì)提取辣椒堿含量影響的主次順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>酶解溫度>酶添加量>料液比>SSL的添加量>粒度；各因素對(duì)提取辣椒二氫堿含量影響的主次順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>酶添加量>酶解溫度>粒度>料液比>SSL的添加量，而最優(yōu)水平組合為A3B1C2D1E3F2，即纖維素酶添加量0.4%(W/W)、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度45 ℃、料液比1∶8 (g/mL)、SSL的添加量1%(W/W)、辣椒粒度100目，此時(shí)，辣椒堿的含量可達(dá)7.82 mg/g，辣椒二氫堿的含量為4.94 mg/g。

表3 提取辣椒紅色素的正交試驗(yàn)的因素水平表

表4 提取辣椒紅色素的正交試驗(yàn)的結(jié)果分析表

由表3和表4可知，各因素對(duì)提取辣椒紅色素含量影響的主次順序?yàn)椋毫６?酶解時(shí)間>SSL的添加量>料液比>酶解溫度>酶添加量，而其最優(yōu)水平組合為A2B3C3D1E1F2，即酶添加量0.8 %(W/W)、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度55 ℃、料液比1∶5(g/mL)、SSL的添加量0.6%(W/W)，辣椒粒度為粉碎后過100目篩，此時(shí)，辣椒紅色素的含量為31.25 mg/g。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)初步確定了表面活性劑輔助酶解法提取辣椒堿、辣椒二氫堿的最優(yōu)條件為：纖維素酶添加量為0.4%(W/W)，酶解時(shí)間為4 h，酶解溫度為45 ℃，料液比為1∶8 (g/mL)，SSL的添加量為1%(W/W)，辣椒粒度為100目；提取辣椒紅色素的最優(yōu)條件為：纖維素酶的添加量為0.8 %(W/W)，酶解時(shí)間為2 h，酶解溫度為55 ℃，料液比為1∶5 (g/mL)，SSL的添加量為0.6%(W/W)，辣椒粒度為粉碎后過100目。在此優(yōu)化條件下，辣椒堿的含量可達(dá)7.82 mg/g，辣椒二氫堿的含量為4.94 mg/g，辣椒紅色素的含量為31.25 mg/g，相比不添加酶的空白處理，分別增加了3.53，2.82，20.01 mg/g，3種物質(zhì)的含量都達(dá)到了較高水平，有用于實(shí)際生產(chǎn)的應(yīng)用前景。同時(shí)研究還表明，表面活性劑輔助酶解提取法可以有效降低酶解工藝中的成本，在天然產(chǎn)物有效成分的提取中具有廣闊的應(yīng)用前景。