卓麗丹 馮頂麗 蘆笛 郭紅延 李紅

1976 年，首次通過貼壁培養(yǎng)的方法分離，發(fā)現(xiàn)兔骨髓中存在能貼附于塑料培養(yǎng)皿，呈長菱形樣成纖維樣的細(xì)胞，成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)[3],單個(gè)細(xì)胞呈紡錘狀或者梭形，整體呈菊花狀或同心圓狀排列。Zuk等[4]首次從脂肪組織中分離出一種成纖維樣細(xì)胞，其形態(tài)與BMSCs形態(tài)相似, 具有自我更新和多向分化的能力，稱之為脂肪干細(xì)胞(adipose stem cells,ADSCs)。

BMSCs和ADSCs來源廣、取材方便、易培養(yǎng)且有穩(wěn)定傳代增殖能力，是骨組織工程常用的種子細(xì)胞[4-5]，為了研究兩者之間的具體差異，通過增殖能力、流式檢測、成骨誘導(dǎo)以及相關(guān)基因檢測方面進(jìn)行查看兩者之間的差別。

1 資料與方法

1.1 材料

α-MEM(Gibico，USA)；血清(天市灝羊生物科技有限公司)；青霉素、鏈霉素(北京吉諾恩泰生物科技有限公司)；抗壞血酸、地塞米松、左旋β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶、dispase酶、RNA提取試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(Sigma，USA)。

1.2 主要試劑及儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱(Thermo，USA)；流式細(xì)胞儀 (BD，USA)；離心機(jī)(Heraens Cryofuge 8000，德國)；I型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；RT-PCR檢測儀(AXYGEN，USA)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取健康3～4 周SD大鼠，脂肪組織分離及鑒定按照我室已建立的方法[6]。在腹部剪梭形切口，暴露腹股溝脂肪墊，取腹股溝處脂肪，無菌PBS清洗3 次，去除脂肪外面所黏連的包膜、肉眼可見的小血管以及較明顯的結(jié)締組織。將脂肪組織剪碎大約形成1 mm3并加入1 ml Ⅳ型膠原酶、1 ml dispase酶、4 ml 0.25%胰酶、4 ml H-DMEM。37 ℃、5%CO2消化15 min，100目、200目過濾網(wǎng)過濾，1 000 rpm/min離心5 min，重懸計(jì)數(shù)，按照2×106接種于中皿，第2天首次進(jìn)行換液去未貼細(xì)胞，隨后觀察細(xì)胞長到90%時(shí)進(jìn)行1∶3進(jìn)行傳代。

參考俞婉璐等[7]提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，提取上述大鼠髂骨，并剔除附著肌肉，無菌PBS沖洗3 次，兩端剪除少許骨垢端，暴露骨髓腔。用1 ml注射器吸取完全培養(yǎng)基，插入骨髓腔，輕柔沖洗骨髓腔，沖洗骨髓腔至透明，收集骨髓沖洗液，于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。接種后第48小時(shí)進(jìn)行1 次半換液，間隔72 h 第1次全換液。此后每隔2 d給細(xì)胞全換液1 次，逐漸純化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.3.2 大鼠BMSCs和ADSCs生長能力繪制 P2代大鼠BMSCs和ADSCs增殖達(dá)到90%時(shí)，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按 2×104/ml 接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2 ml/孔，共27 孔，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。24 h消化細(xì)胞顯微鏡下計(jì)數(shù)。每隔24 h計(jì)數(shù)1 次，每次消化3 孔，進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)9 d。

1.3.3 細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測 取P3、P10代BMSCs和ADSCs細(xì)胞，0.25%的胰酶消化，離心后重懸細(xì)胞，分裝5 支EP管(分別標(biāo)記A、B、C、D、E)細(xì)胞數(shù)約3×105/EP。在1 200 r/min離心8 min用PBS離心洗滌兩次。加入100 μl PBS重懸細(xì)胞分別加入抗體，抗大鼠CD45(B),CD29(C),CD90(D)、抗大鼠CD34(E)及空白對(duì)照(A)僅加PBS,放置4 ℃搖床30 min。在1 200 r/min離心8 min用PBS離心洗滌2 次，E管經(jīng)洗滌后加入FITC二抗放置4 ℃搖床30 min，E管在1 200 r/min離心8 min用PBS再次離心洗滌2 次。使用400 μl PBS重懸細(xì)胞，然后使用流式細(xì)胞檢測儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記情況。

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1.3.4 大鼠BMSCs和ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo) P2代細(xì)胞生長達(dá)90%時(shí)消化計(jì)數(shù)，1×106接種于6 孔板,第2日成骨誘導(dǎo)，成骨誘導(dǎo)液(含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-7mol/L 地塞米松、50 mg/L左旋抗壞血酸)，另外設(shè)置一對(duì)照組只添加完全培養(yǎng)基，每間隔1 d更換誘導(dǎo)液。分別在7、14、21 d進(jìn)行ALP染色,28 d茜素紅染色,在倒置顯微鏡下拍照對(duì)比。

1.3.5 ALP染色 按照ALP試劑盒說明書染色，誘導(dǎo)特定時(shí)間的BMSCs、ADSCs棄去上清，PBS清洗2 次；加入固定液(1.96 ml蒸餾水、0.04 ml檸檬酸、7.5 ml丙酮)30 s，蒸餾水洗滌2 次；加入染色液(0.05 ml FVB、2.35 ml蒸餾水、0.1 ml AS-MX)，6 孔板/ml、12 孔板/500 μl,室溫靜置30 min后，蒸餾水清洗2 次，留少量的液體拍照，對(duì)于拍照結(jié)果利用IMAGE J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3.6 茜素紅染色 ①1%茜素紅配制：0.1 mol/L的 tris-Hcl 100 ml(pH 8.3)加入0.1 g茜素紅S，4 ℃保存;②誘導(dǎo)完成的BMSCs和ADSCs用PBS沖洗3 次；4%多聚甲醛固定30 min；茜素紅染色5 min；蒸餾水沖洗，留少量液體進(jìn)行拍照。同時(shí)對(duì)于拍照結(jié)果利用IMAGE J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3.7 大鼠BMSCs和ADSCs成骨誘導(dǎo)后成脂相關(guān)基因的RT-PCR 比較 成骨誘導(dǎo)7、14、21 d，使用Trizol提取總RNA，測量RNA 濃度，定量反轉(zhuǎn)錄形成cDNA,然后進(jìn)行PCR檢測。成骨相關(guān)基因引物為SATB2,核心蛋白(RUNX2),骨涎蛋白(BSP),骨鈣素(OCN)相關(guān)引物序列參考表 1。PCR的反應(yīng)體系為：2 ×T5 Fast Qpcr Mix 10 μl,上下引物分別為0.5 μl，cDNA 1 μl，DEPC水8 μl，反應(yīng)體系為20 μl體系，擴(kuò)增條件為 95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40 個(gè)循環(huán)。IQ5 Optical System Software 計(jì)算出最終各組相對(duì)表達(dá)值。

表 1 RT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 7,兩樣本均數(shù)采用組間t檢驗(yàn)，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMSCs和ADSCs形態(tài)學(xué)觀察

原代BMSCs，3 d后換液發(fā)現(xiàn)克隆團(tuán)塊，5～7 d細(xì)胞增殖速度較快，細(xì)胞成長梭形，渦旋狀分布，純度較高。原代ADSCs，貼壁較快，5 h左右貼壁完成，3 d常滿皿底，細(xì)胞成短梭狀，其中有些細(xì)胞呈三角形等不規(guī)則形態(tài)，經(jīng)傳代純化細(xì)胞。P3代BMSCs和ADSCs純度較高，細(xì)胞呈長梭狀分布，類似成纖維細(xì)胞，呈渦旋狀分布,通過此方法可以穩(wěn)定遺傳至10 代(圖 1)。

2.2 大鼠BMSCS和ADSCS生長曲線

P3代BMSCs和ADSCs連測9 d，BMSCs前兩天生長速度快于ADSCs，隨后ADSCs的生長速度明顯高于BMSCs，說明ADSCs有較大的生長潛力(圖 2)。

2.3 流式結(jié)果分析

P3、P10 BMSCs流式結(jié)果顯示：CD34和CD45表達(dá)率較低，CD29和CD90表達(dá)率分別為90%和95%以上，強(qiáng)陽性。P3、P10 ADSCs也表現(xiàn)出CD34、CD45表達(dá)率低和CD29、CD90的強(qiáng)陽性表達(dá)(圖 3)。

圖 1 BMSCs和ADSCs細(xì)胞的形態(tài)特征 (×200)

Fig 1 Morphological characteristics of BMSCs and ADSCs (×200)

圖 2 P3代 BMSCs和ADSCs增殖曲線

2.4 大鼠BMSCs和ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)和相關(guān)基因檢測

誘導(dǎo)7 d ALP染色，BMSCs (圖 4A)著色范圍較廣，且藍(lán)紫色較深，ADSCs(圖 4D)細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化，少部分著色；至誘導(dǎo)21 d ALP染色，BMSCs(圖 4C)和ADSCs(圖 4F) 發(fā)現(xiàn)BMSCs染色強(qiáng)于ADSCs,由長梭形逐漸變?yōu)榱⒎叫?，呈?fù)層結(jié)構(gòu)，形成細(xì)胞膜片,隨后形成多角形的成骨樣細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)顏色變深，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加。4 周后發(fā)現(xiàn)，不透光團(tuán)狀礦物質(zhì)結(jié)節(jié)，茜素紅染色，顯微鏡下觀察到細(xì)胞外基質(zhì)有橘紅色或者紅色礦物質(zhì)結(jié)節(jié)，BMSCs明顯多于ADSCs，IMAGE J分析結(jié)果表明，ALP染色7、14 d(P<0.01)21 d(P>0.05)；茜素紅染色(P<0.01)，BMSCs成骨

圖 3 BMSCs和ADSCs表面抗原標(biāo)記物的表達(dá)

圖 4 成骨誘導(dǎo)后ALP染色以及半定量分析結(jié)果 (×200)

圖 5 成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色以及半定量分析 (×200)

圖 6 qPCR定量檢測BMSCs和ADSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)

能力強(qiáng)于ADSCs(圖 5)。qPCR檢測結(jié)果表明，BSP、SATB2(P<0.01)OCN、RUNX2在BMSCs中表達(dá)均高于ADSCs(P<0.05)(圖 6)。

3 討 論

干細(xì)胞研究正在向醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域交叉滲透，其與生物材料復(fù)合進(jìn)行骨組織工程構(gòu)建將具有強(qiáng)大影響和應(yīng)用前景的生命科學(xué)研究領(lǐng)域[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)主要研究關(guān)于種子細(xì)胞BMSCs和ADSCs之間在體外基礎(chǔ)生物學(xué)特性方面的差異[11]。將來自相同物種，年齡和性別(3～4 周齡雄性Sprague-Dawley大鼠)的BMSCs和ADSCs進(jìn)行對(duì)比。通過貼壁培養(yǎng)提取原代BMSCs、ADSCs，兩者之間沒有顯著的形態(tài)學(xué)差異，但BMSCs比ADSCs花費(fèi)的時(shí)間更長，可能是低接觸抑制這與Lotfy等[12]和Zhu等[13]的研究結(jié)果一致。經(jīng)過3 代的純化，細(xì)胞生長較好，增殖旺盛，形態(tài)均一穩(wěn)定。流式細(xì)胞檢測CD29、CD90陽性率高達(dá)99%以上，細(xì)胞表面抗原CD45以及造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34表達(dá)率較低與文獻(xiàn)[14]一致。通過此方法獲得的干細(xì)胞可穩(wěn)定遺傳達(dá)10代，P10代流式結(jié)果顯示CD29、CD90陽性率高達(dá)98%以上，細(xì)胞表面抗原CD45以及造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34為表達(dá)率低，說明BMSCs、ADSCs仍保持著穩(wěn)定的增殖能力。

同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明BMSCs、ADSCs體外均有成骨分化的能力，成骨誘導(dǎo)液(10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-7mol/L 地塞米松、50 mg/L左旋抗壞血酸)，誘導(dǎo)BMSCs、ADSCs 7、14、21 d后，ALP染色可見：BMSCs顏色深度以及著色范圍均強(qiáng)于ADSCs，著色強(qiáng)度及范圍隨著時(shí)間的增加而加強(qiáng)，細(xì)胞為多角形的成骨樣細(xì)胞。誘導(dǎo)28 d茜素紅染色觀察到細(xì)胞外基質(zhì)有橘紅色或者紅色礦物質(zhì)結(jié)節(jié)，BMSCs明顯多于ADSCs，與文獻(xiàn)[15]一致。

早期表達(dá)蛋白BSP、晚期表達(dá)蛋白OCN、核機(jī)制蛋白SATB2、核心蛋白R(shí)UNX2是骨分化過程中重要的調(diào)控因子，其表達(dá)量可反映細(xì)胞的成骨能力。BSP是骨標(biāo)志性蛋白,是一種硫酸化的磷蛋白和高度糖基化,能激活成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨礦化[16]。OCN一般僅由成骨細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)蛋白，具有調(diào)節(jié)基質(zhì)鈣化的作用，其濃度可以作為成骨細(xì)胞活動(dòng)的標(biāo)志[17]。SATB2是新近發(fā)現(xiàn)的特殊富含序列結(jié)合蛋白家族的成員,它可結(jié)合到核基質(zhì)結(jié)合區(qū)并以依賴的方式激活基因轉(zhuǎn)錄過程，可正向調(diào)節(jié)多種成骨細(xì)胞的特異性基因如BSP和OCN的表達(dá)[18]。RUNX2 是成骨分化過程中關(guān)鍵的調(diào)控因子，能夠調(diào)控眾多基因的轉(zhuǎn)錄，RUNX2缺失的鼠中，成骨細(xì)胞的分化完全被抑制，均不發(fā)生骨膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨[19]。通過RT-qPCR檢測誘導(dǎo)后BMSCs和ADSCs成骨相關(guān)基因 BSP、OCN、SATB2、RUNX2可發(fā)現(xiàn)：在成骨分化過程中BSP隨著時(shí)間的延長而較少；OCN隨著時(shí)間的延長而增多，但BMSCs表達(dá)量仍高于ADSCs；SATB2在14 d時(shí)達(dá)到較高水平，隨后逐漸降低；RUNX2在誘導(dǎo)期間一直處于高表達(dá)水平，說明在成骨分化過程中起著至關(guān)重要的作用[20]，且文獻(xiàn)中提到RUNX2具有促進(jìn)BMP、OCN、STAB2、ALP和Ⅰ型膠原等成骨基因的表達(dá)[21-22]，這些因子可通過作用于轉(zhuǎn)錄過程或相互作用促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。

研究結(jié)果表明，貼壁培養(yǎng)的BMSCs、ADSCs具有穩(wěn)定的自我復(fù)制增殖能力。此外，發(fā)現(xiàn)ADSCs比BMSCs增殖能力更強(qiáng)，體外研究中預(yù)測，在臨床前和臨床應(yīng)用中，ADSCs比BMSCs更容易生長，但與BMSCs相比，其成骨分化能力較低。這表明BMSCs在治療骨疾病方面可能比ADSCs更有效。該研究結(jié)果為臨床應(yīng)用中種子細(xì)胞和處理方式的選擇奠定理論基礎(chǔ)。