萬 建， 胡 原， 秦麗瑋， 熊國梅， 李 兵， 萬翠紅, 楊繼紅

(華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北省生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心;國家級生物學(xué)虛擬仿真實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,武漢 430079)

0 引 言

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的對象是一個基因組所表達(dá)的全部蛋白[1]，是溝通基因組到最終生物表型的重要環(huán)節(jié)[2]，為科研工作者探究生命系統(tǒng)活動和內(nèi)部復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)理提供了一個新的思路[3]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，蛋白組學(xué)的研究水平得到了飛速進(jìn)步[4]。

近年來質(zhì)譜質(zhì)量分析技術(shù)快速發(fā)展[5]，從最初的三重四級桿到離子井、飛行時間再到現(xiàn)在的傅里葉變換[6]。質(zhì)譜分析的精確度和分辨率取得了質(zhì)的飛躍。Nano-LC-Q-Obitrap將納升級液相色譜的高分離性能與高分辨的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)Orbitrap檢測技術(shù)相結(jié)合，具備優(yōu)異性能和出色多功能性。為生命科學(xué)特別是蛋白組學(xué)領(lǐng)域提供了高質(zhì)量的研究分析手段[7]。

為拓展學(xué)生專業(yè)視野，使學(xué)生了解目前生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)[8]。實(shí)驗(yàn)中心將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)應(yīng)用到研究生教學(xué)中。本文通過實(shí)驗(yàn)摸索建立了一套基于納升級液相色譜與高分辨質(zhì)譜(Obitrap)聯(lián)用的實(shí)驗(yàn)方法，以人類全蛋白標(biāo)樣為材料，完成蛋白質(zhì)的樣品制備、液相色譜分離、質(zhì)譜檢測、蛋白質(zhì)定量分析、生物信息分析的主要實(shí)驗(yàn)流程體系[9]。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

人類全蛋白酶解標(biāo)準(zhǔn)樣品(Promega公司，美國)；色譜純乙腈(Fisher公司，美國)；色譜純水(Fisher公司，美國)；色譜純甲酸(Fluka公司，瑞士)。

1.2 主要儀器及軟件

納升級液相色譜Easy-nLC1200(ThermoFisher公司，美國)；Obitrap質(zhì)譜儀Q-Exactive Plus(ThermoFisher公司，美國)；小型渦旋儀MX-S(SCILOGEX公司，美國)；小型低速離心機(jī)D1008(SCILOGEX公司，美國)；蛋白分析鑒定軟件Proteome Discoverer 2.1 SP1(ThermoFisher公司，美國)；蛋白數(shù)據(jù)庫檢索網(wǎng)站(http://www.uniprot.org/)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

將購置的人類全蛋白酶解多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品用純水溶解，配成濃度為1 μg/μL的樣品，在配好的樣品中按照0.1%的體積比加入色譜純級別的甲酸。渦旋混勻后離心備用。

2.2 色譜分離

色譜柱：預(yù)柱為Acclaim PepMap,C18,100 μm×2 cm,5 μm,10 nm(100 ?);分析柱為Acclaim PepMap,C18,50 μm×15 cm,2 μm,10 nm(100 ?)。

流動相：A相為含有0.1%甲酸的純水；B相為含有10%純水的乙腈，并加有0.1%的甲酸。流速為300 nL/min，洗脫梯度[10]見表1。色譜流出樣品直接通過HESI離子源進(jìn)入質(zhì)譜。液相色譜進(jìn)樣量1 μL。

表1 色譜洗脫梯度

2.3 質(zhì)譜檢測

納升級液相色譜分離后的多肽組分進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測分析。主要質(zhì)譜參數(shù)：離子源電壓2 kV；質(zhì)譜采集模式為正離子模式；一級質(zhì)譜采集分子量范圍350～2 000 m/z;分辨率70 000；最大離子注入時間20 ms;二級質(zhì)譜采集分辨率17 500；最大離子注入時間50 ms;TopN設(shè)定為20；碎裂能量設(shè)定為27 eV。

2.4 生物信息學(xué)分析

在開放的蛋白數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站Uniport(http://www.uniprot.org/)上查找人類全蛋白的氨基酸序列，并以FSATA格式進(jìn)行下載[11]。導(dǎo)入到Proteome Discoverer 2.1 SP1軟件中進(jìn)行蛋白數(shù)據(jù)庫檢索。檢索參數(shù)設(shè)定：比對多肽質(zhì)量范圍350 Da～5 000 Da;信噪比(S/N)>1.5;多肽片段中氨基酸個數(shù)范圍6～144；母離子誤差<10×10-6；多肽片段誤差<0.2 Da;正反數(shù)據(jù)庫比對檢驗(yàn)閾值，顯著0.05，極顯著0.01。

3 結(jié)果分析與討論

3.1 質(zhì)譜檢測結(jié)果分析

分析實(shí)驗(yàn)使用的人類全蛋白酶解多肽標(biāo)樣在質(zhì)譜的總離子流(TIC)分布情況，總離子流分布均勻，并且質(zhì)譜峰型分離明顯可反映出液相色譜設(shè)置的合理與否，同時峰強(qiáng)度也可反映質(zhì)譜檢測的效率。納升級液相色譜屬于微量色譜，最小可在0.5 μL的上樣條件下完成樣品的高效分離。本次實(shí)驗(yàn)選用色譜分析柱填料為2 μm，在超過50 MPa(500 bar)的柱壓下完成分析。實(shí)驗(yàn)采用數(shù)據(jù)依賴的質(zhì)譜采集模式，完成一級質(zhì)譜掃描后，依據(jù)一級質(zhì)譜的結(jié)果，對質(zhì)譜峰強(qiáng)度較高的母離子進(jìn)行二級碎裂檢測，得到二級質(zhì)譜檢測結(jié)果。依據(jù)此策略可獲得樣品中含量較高的離子二級質(zhì)譜碎裂信息[12]。

3.2 質(zhì)譜譜圖分析

實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)入質(zhì)譜的樣品為人類全蛋白酶解后的多肽片段，故質(zhì)譜比對時也是以多肽片段為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對。例如，完成多肽序列比對后的結(jié)果(見圖1)，比對上的多肽氨基酸序列為TAVCDIPPR。質(zhì)譜中的高能碰撞池主要是對肽段主鏈的氨基進(jìn)行裂解，一般而言，總是產(chǎn)生等量的b 和y 碎片離子。一個滿意的序列分析一般需要對母離子進(jìn)行主鏈裂解后的完全或接近完全的指認(rèn)和歸屬[13]。此肽段由8個氨基酸組成，共比對上b碎片離子4個，y碎片離子8個(見圖2)。

圖1 多肽氨基酸序列碎片信息

依據(jù)此方法完成人類全蛋白的多肽序列比對，根據(jù)多肽片段的交叉覆蓋度完成全蛋白序列的拼裝。

3.3 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索

使用專業(yè)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件Proteome Discoverer 2.1 SP1完成蛋白質(zhì)的鑒定[14]。依據(jù)button-up的策略，首先將大蛋白酶解為多肽片段，通過對多肽片段的鑒定，根據(jù)多肽片段的覆蓋度完成蛋白氨基酸序列的組裝，從而完成蛋白質(zhì)的鑒定[15]。本次實(shí)驗(yàn)，首先篩選得到質(zhì)量較好的質(zhì)譜圖42 625張，通過與Uniport數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中的人類全蛋白多肽片段碎裂譜圖比對，匹配上的質(zhì)譜圖22 592張，鑒定到肽段序列15 368條，這些肽段與數(shù)據(jù)庫中的3 617個蛋白氨基酸序列匹配。對這些蛋白氨基酸序列去除重復(fù)最終鑒定到2 939個蛋白質(zhì)。分析蛋白匹配的細(xì)節(jié)，可得到更多的信息。圖3展示的是人類全蛋白中鑒定到的α-微管蛋白，蛋白氨基酸序列中有72.36%匹配到數(shù)據(jù)庫中α-微管蛋白。實(shí)驗(yàn)采用button-up的策略的蛋白鑒定策略，酶解后的多肽拼裝蛋白序列，由于樣品肽段覆蓋度及檢索比對方法設(shè)置等原因比對結(jié)果很難達(dá)到100%。

圖2 多肽氨基酸序列質(zhì)譜圖比對

圖3 人類全蛋白氨基酸序列比對結(jié)果

3.4 生物信息學(xué)分析

具有相似序列的蛋白質(zhì)具有相似的功能。因此，最可靠的確定蛋白質(zhì)功能的方法是進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的相似性搜索。并且許多功能可直接依據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測出來。例如，疏水性信息可用于跨膜螺旋的預(yù)測[16]。通過Proteome Discoverer 2.1 SP1軟件完成蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫比對，得到檢測蛋白在細(xì)胞中的定位以及蛋白功能預(yù)測。統(tǒng)計(jì)分析得到參與代謝過程的蛋白為鑒定到總蛋白數(shù)量的24.8%，參與細(xì)胞組成的蛋白14.7%、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白11.4%、生物調(diào)控蛋白19.78%、應(yīng)激反應(yīng)蛋白13.15%、其他未鑒定到功能的蛋白16.17%，見圖4。

圖4 蛋白質(zhì)功能預(yù)測統(tǒng)計(jì)結(jié)果

生物信息學(xué)是目前生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的熱點(diǎn)之一，而蛋白組學(xué)后續(xù)的數(shù)據(jù)處理很大程度上依賴生物信息學(xué)的發(fā)展。通過將生物信息學(xué)分析融入到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，使學(xué)生們感受到生物信息學(xué)在數(shù)據(jù)分析中的強(qiáng)大功能。幫助他們在今后的學(xué)習(xí)和科研工作中更好地認(rèn)識學(xué)科交叉的意義。

4 結(jié) 語

應(yīng)用于教學(xué)的實(shí)驗(yàn)需要做到實(shí)驗(yàn)原理明確，實(shí)驗(yàn)步驟簡單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定易得、再現(xiàn)性高[17]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)滿足以上要求，且全部實(shí)驗(yàn)步驟耗時在2～3 h，但由于受到大型儀器設(shè)備使用的限制，使得本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)僅適合小班教學(xué)，故在研究生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推行本實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)。

實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生可自主完成大型液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀器的樣品檢測，同時了解色譜洗脫梯度以及質(zhì)譜檢測模式的設(shè)定對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。了解高分辨質(zhì)譜儀器的性能，擴(kuò)寬學(xué)生對現(xiàn)代生物學(xué)分析儀器的認(rèn)識。同時也讓大型儀器在教學(xué)方面發(fā)揮作用，更好地服務(wù)于教學(xué)與科研。實(shí)驗(yàn)基于目前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域蛋白組學(xué)，融合了生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)以及分析化學(xué)等領(lǐng)域的知識，使學(xué)生們體會到學(xué)科交叉對本學(xué)科的推動作用，增加學(xué)生對科研的興趣。